兩種制備雞肝癌細胞染色體方法的比較

汪偉偉，張文玲，王曉菲，張晨晰，張立文，田亞平

解放軍總醫(yī)院，北京 100853 1轉(zhuǎn)化醫(yī)學實驗室；2臨床檢驗科

禽類作為重要的經(jīng)濟動物和理想的生物反應(yīng)器，具有廣闊的應(yīng)用前景[1-2]。以禽類模型建立相應(yīng)的細胞系，可以用于多種病毒的增殖和純化[3]，還可以用來評價環(huán)境中化學物質(zhì)的毒性作用[4]。與哺乳動物原代細胞相比，用細胞系生產(chǎn)制造疫苗具有更突出的優(yōu)勢[5]。特定的細胞系用于疫苗生產(chǎn)前，需按規(guī)定對其進行全面鑒定并建立細胞種子庫[6]，且傳代細胞在一定代次后細胞的致瘤性會增強[7]。選擇一種永生性細胞系代替原代細胞增殖病毒用于疫苗生產(chǎn)非常必要，而細胞核型反映物種的種質(zhì)特性，是再現(xiàn)性很高的細胞遺傳學信息，可以證明傳代細胞的穩(wěn)定性[8-12]。為了保證細胞系的純凈和安全性，確保細胞系有清楚的遺傳背景，對細胞系進行染色體核型分析必不可少[5-6]。雞肝癌細胞系(LMH)最早是由日本于1981年建立，目前常用于疫苗生產(chǎn)制造及藥物篩選體外實驗[13]。Kawaguchi等[14]通過對LMH細胞系第30代和第120代的細胞核型分析得到該細胞系的染色體數(shù)目為88 ～ 124條，并且都含有6條標記染色體。證明了該細胞系穩(wěn)定性好，符合生產(chǎn)生物制品對細胞核型的要求。但Kawaguchi等制備的染色體短小，分散困難，顯帶后難分辨，且重復性較差，很難為LMH細胞系在生物領(lǐng)域的擴展應(yīng)用奠定穩(wěn)定基礎(chǔ)。因此，我們總結(jié)了羊水細胞、人類淋巴系統(tǒng)腫瘤細胞以及雞外周血細胞的染色體核型制備方法[15-17]，建立了兩種新的LMH細胞染色體制備方法，并對這兩種方法進行了比較。

材料和方法

1 細胞及試劑 由北京市農(nóng)林科學院畜牧獸醫(yī)研究所提供的24瓶貼壁生長的雞肝癌細胞。秋水仙素濃度為250μg/ml；固定液(甲醇∶冰乙酸=3∶1)；低滲液：0.6%枸櫞酸鈉；緩沖液：磷酸氫二鉀(1.79 g)和磷酸二氫鈉(0.78 g),加入1 L超純水配制而成；Giemsa染液；0.1%明膠；10%NaHCO3；0.5%的胰酶溶液。

2 分組 將24瓶細胞系分為兩組，每組12瓶。一組在細胞傳代前，先用0.1%明膠覆蓋培養(yǎng)瓶底1 h；另一組直接接種細胞于培養(yǎng)瓶中。所有細胞傳代后均培養(yǎng)72 h。明膠處理后的細胞采用原位法制備染色體，不作處理一組則采用滴片法制備染色體。

3 原位法制備染色體 向LMH細胞培養(yǎng)液中加入250μg/ml的秋水仙素150μl，輕輕混勻，放回37℃ CO2恒溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)60 min。棄去培養(yǎng)液，加入37℃預溫的0.6%枸櫞酸鈉9 ml；在37℃恒溫環(huán)境中低滲處理40 min。每個培養(yǎng)瓶中加入2 ml新配制的固定液(甲醇∶冰乙酸=3∶1)，靜置2 min；吸取2 ml懸液后再加入2 ml固定液，靜置2 min；重復以上步驟3次。棄去瓶中液體，加入9 ml固定液，放入4℃冰箱中低溫固定50 min。棄去瓶中固定液，放入65℃烤箱中老化3 h，自然冷卻待消化。取0.5%胰酶溶液1 ml和10% NaHCO31 ml，加入盛有50 ml 0.9%氯化鈉注射液的染缸中混勻，置37℃預溫。用吸管吸取5 ml的胰酶混合液迅速加入到培養(yǎng)瓶中，讓混合液均勻鋪在瓶底。消化50 s，倒掉瓶中的消化液，加入Giemsa染液染色18 min。

4 滴片法制備染色體 向LMH細胞培養(yǎng)液中加入250μg/ml的秋水仙素150μl，輕輕混勻，放回37℃ CO2恒溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)60 min。棄去培養(yǎng)液，加入37℃預溫的0.6%枸櫞酸鈉9 ml；在37℃恒溫環(huán)境中低滲處理40 min。輕輕吹打細胞及瓶壁，將懸液倒入15 ml離心管中，加入1 ml新配制的固定液(甲醇：冰乙酸=3：1)，輕輕吹打混勻，2 000 r/min離心10 min。棄上清，加入5 ml固定液，輕輕吹打混勻后，立即2 000 r/min離心10 min。重復以上步驟2次，棄上清，加入適量的固定液，制成懸液。吸取少量細胞懸液，滴3 ～ 4滴于冰水浸泡過的載玻片上，在酒精燈上來回過火數(shù)次，將玻片放入65℃烤箱中烤片3 h，自然冷卻待消化。取0.5%胰酶溶液1 ml和10% NaHCO31 ml，加入盛有50 ml 0.9%氯化鈉注射液的染缸中混勻，置37℃預溫。將玻片放入胰酶混合液中消化10 s，用0.9%氯化鈉注射液涮洗后，Giemsa染液染色5 min。

5 統(tǒng)計學分析 所有數(shù)據(jù)均使用SPSS21.0統(tǒng)計軟件分析，組間核型數(shù)量及染色體相對長度比較采用t檢驗，染色體數(shù)目采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 核型數(shù)量比較 在10倍物鏡下對兩種方法制備的染色體進行觀察，發(fā)現(xiàn)原位法制備的染色體核型數(shù)量明顯多于滴片法。在20倍物鏡下，我們對兩種方法制備的玻片各選取了10個視野，將每個視野中發(fā)現(xiàn)的核型數(shù)量進行統(tǒng)計，結(jié)果顯示原位法制備的染色體核型數(shù)量遠遠高于滴片法(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計學意義。見圖1、表1。

2 染色體數(shù)目比較 兩種方法制備的染色體均通過100倍物鏡進行觀察，鏡下可見原位法制備的核型較為緊密，滴片法制備的核型較為分散。從兩種方法制備的核型中各選取50個條帶良好的核型，記錄每個核型中染色體條數(shù)，將相同染色體條數(shù)的核型歸為一種類型，統(tǒng)計不同染色體條數(shù)的出現(xiàn)頻數(shù)。結(jié)果顯示原位法制備的核型類型多于滴片法(P=0.123)，但差異無統(tǒng)計學意義。見圖2、圖3、表2。

3 染色體形態(tài)比較 從兩種方法制備的玻片中各選取10組條帶清晰的細胞核型，根據(jù)染色體的條帶和形態(tài)將染色體分別進行排列，觀察比較兩種方法制備的核型，均能發(fā)現(xiàn)6條標記染色體，8對大染色體和一對性染色體，其余為小染色體及微小染色體。排列好的核型列于圖4中。

4 染色體相對長度比較 通過北昂分析軟件測量兩種方法制備的各條大染色體、性染色體和標記染色體的相對長度，以-x±s表示，兩種方法獲得的同組別染色體相對長度無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。見表3。

表1 兩種方法在20倍物鏡下染色體核型數(shù)目比較Tab. 1 Comparison of karyotype number between two methods under 20 times objective lens

圖 1 10倍物鏡下兩種方法制備的染色體核型數(shù)量比較A：原位法；B：滴片法Fig. 1 Comparison of karyotype number between two methods under 10 times objective lensA: in-situ method; B: dropmethod

圖 3 兩種方法制備的所含不同染色體數(shù)目的核型分布Fig. 3 Comparison of karyotype distribution between two methods

表2 兩種方法制備的不同染色體條數(shù)的核型種類及出現(xiàn)頻數(shù)Tab. 2 Types and occurrence frequency of karyotypes prepared by two methods

表3 兩種方法制備的LMH細胞染色體相對長度比較Tab. 3 Comparison of average chromosome relative length with two methods (-x±s, %)

討 論

染色體核型分析可以用于證明雜交次瘤細胞是兩親本細胞產(chǎn)物[18-19]，可以排除細胞在培養(yǎng)過程中的污染和細胞株的錯誤鑒別[20-23]。在眾多的細胞鑒別技術(shù)中，染色體可以通過倍型、帶型檢查是否有缺失和突變[24-25]。目前有關(guān)雞的染色體制備及核型分析已有較多報道，但LMH細胞的染色體制備及核型分析罕見。

LMH細胞屬于貼壁培養(yǎng)細胞，Kawaguchi等[14]采用0.2%胰酶將細胞從瓶壁上消化下來，但胰酶消化對溫度、細胞集落大小、消化時間長短都要有所考慮，難以控制把握[15]。我們發(fā)現(xiàn)LMH細胞貼壁并不牢固，在低滲處理時細胞就已經(jīng)從培養(yǎng)瓶上脫落，因此在低滲后只需要將脫落細胞轉(zhuǎn)移至離心管中即可，并不需要胰酶處理。原位法為了讓細胞貼壁牢固，增加細胞收獲的可靠性，在細胞培養(yǎng)前就用0.1%明膠鋪于培養(yǎng)瓶底。有文獻指出轉(zhuǎn)移貼壁細胞時，容易導致細胞的丟失、核型減少[26]。兩種制備方法結(jié)果也顯示原位法收獲的核型數(shù)量大于滴片法，且存在顯著差異。

秋水仙素和染色體長短有密切關(guān)系。秋水仙素加入過量或處理時間過長，可導致分裂細胞多，染色體凝集和收縮變小，或發(fā)生異常分裂現(xiàn)象，甚至染色體破碎，不宜用于染色體形態(tài)觀察及計數(shù)；秋水仙素加入太少或處理時間偏短可導致染色體形態(tài)偏長或無中期分裂象[27]。我們參考相關(guān)文獻[28-29]，結(jié)合本實驗室對人類外周血染色體核型的制備經(jīng)驗，將兩種方法加入的秋水仙素濃度均定為250μg/ml，加入150μl作用60 min。

低滲處理主要用于誘導淋巴細胞膨脹，在后期滴片時有利于染色體從細胞中分散出來。有學者通過細胞膜功能對低滲液和固定液的作用進行了闡述[30]。為保證細胞不會因低滲時間過長而導致染色體分散過度，甚至細胞破碎溶解，本實驗的兩種方法均采用0.6%枸櫞酸鈉低滲40 min。

固定液是甲醇與冰醋酸的混合液，目的是維持染色體的形態(tài)。原位法采用2 ml固定液分3次將低滲液置換出來，然后用9 ml固定液直接作用50 min；滴片法則需要經(jīng)過3次固定和離心的過程，較原位法煩瑣。

滴片是滴片法中的一個很重要環(huán)節(jié)，Spurbeck等[31]首次提出了染色體分散動力學，對染色體分散過程做出了詳細闡述。我們采用冷凍濕片，經(jīng)過多次嘗試找到最適高度和過火時間，使染色體鋪展分散良好，但是這一過程很難控制，過于分散的核型不利于染色體計數(shù)。而原位法則省略了此步，分散更為穩(wěn)定。

兩種方法制備的核型結(jié)果與文獻[14]基本相同，但不完全一致，這是由于微小染色體較多，部分染色體未顯色，并且容易發(fā)生羅伯遜易位，滴片法中微小染色體又極易隨液體漂流造成丟失，此外還容易將部分未溶解的染料顆粒及其他雜質(zhì)誤認為是微小染色體[17,32]。

圖 4 兩種方法制備的核型圖比較A:原位法； B：滴片法Fig. 4 Comparison of karyotypes of two methodsA: in-situ method; B: drop method

LMH細胞系來源于雞的肝癌細胞，部分染色體保留了雞類染色體的形態(tài)。不同的文獻對雞的染色體的描述并不相同。李軍和趙金良[33]認為雞的1號染色體為亞中央著絲粒染色體；部分文獻指出2號染色體為亞中央著絲粒染色體[34-36]；還有一部分文獻則認為7號染色體為亞中央著絲粒染色體[36-38]；徐琪等[39]則認為9號染色體為亞中央著絲粒染色體。兩種方法制備的LMH細胞核型中，均可以看見8對大染色體和一對性染色體，大染色體中可見4對亞中央著絲粒染色體，與雞的染色體核型相近，與文獻[14]報道結(jié)果一致。

筆者通過反復實驗，證明原位法較滴片法可收獲更多的核型，便于染色體計數(shù)，提高了分析效率和準確性，因而優(yōu)于滴片法，值得推廣。

1 王令， 張濤， 尹亞軍. 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導的轉(zhuǎn)基因雞研究進展［J］. 中國家禽， 2015， 37（14）： 44-48.

2 靳鍇， 汪怡臨， 左其生， 等. 睪丸注射Mx-NA雙基因制備抗病轉(zhuǎn)基因雞的研究［J］. 中國家禽， 2014， 36（14）： 8-12.

3 付智財， 王家敏， 令世鑫， 等. BHK-21細胞庫的建立及其生物學特性鑒定［J］. 山西農(nóng)業(yè)科學， 2013， 41（8）： 808-812.

4 蔣鵬， 盛南， 王建設(shè)， 等. 五氯酚（PCP）對雞肝癌細胞（LMH）毒性效應(yīng)的機制研究［J］. 生態(tài)毒理學報， 2017（3）： 373-381.

5 欒海萍， 楊素霞， 陳紅巖. MDBK細胞傳代中染色體畸變發(fā)生的研究［J］. 中國優(yōu)生與遺傳雜志， 2015， 23（6）： 30-32.

6 令世鑫， 沈武玲， 徐水林， 等. Marc-145細胞庫的建立及其生物學特性研究［J］. 西北民族大學學報：自然科學版， 2014， 35（1）：69-74.

7 Wei BY， Tan TS， Hassan SS. Replication of a Malaysian Strain Avian Influenza A Virus H5N1 in Madin-Darby Canine Kidney and African Green Monkey Kidney Cells［J］. Sains Malaysiana， 2016， 45（5）：787-793.

8 Glass RI， Bresee JS， Parashar U， et al. Rotavirus vaccines： past，present， and future［J］. Arch Pediatr， 2005， 12（6）： 844-847.

9 劉學平， 魏至棟， 沈勁草， 等. 牛腎組織及其培養(yǎng)物的不同消化法效果評價［J］. 微生物學免疫學進展， 2010， 38（1）： 26-31.

10 竇強， 魏至棟， 謝澎， 等. 牛腎細胞在兩種不同載體中培養(yǎng)效果的比較［J］. 微生物學免疫學進展， 2012， 40（2）： 19-22.

11 林杰， 竇強， 邢家強， 等. 牛腎細胞的凍存及復蘇后連續(xù)傳代的研究［J］. 中國新藥雜志， 2014， 23（9）： 1049-1052.

12 于漾， 畢志香， 揭鴻英， 等. DF-1細胞染色體制備及核型分析［J］. 中國家禽， 2014， 36（17）： 44-46.

13 張晶晶， 陸小軍， 葉奕菁， 等. Kras突變基因真核表達載體的構(gòu)建及在不同肝細胞株中的表達［J］. 現(xiàn)代生物醫(yī)學進展， 2014，14（1）： 18-22.

14 Kawaguchi T， Nomura K， Hirayama Y， et al. Establishment and characterization of a chicken hepatocellular carcinoma cell line， LMH［J］. Cancer Res， 1987， 47（16）： 4460-4464.

15 張玲莉， 陳小波， 嚴慶慶， 等. 羊水染色體制備技術(shù)改良的研究［J］. 中國優(yōu)生與遺傳雜志， 2014， 22（6）： 41-42.

16 薛軍. 造血和淋巴系統(tǒng)實體腫瘤染色體標本制作與分析［J］.分子影像學雜志， 2016（4）： 393-394.

17 李鵬姍， 雷雪芹， 徐廷生， 等. 轉(zhuǎn)基因雞的染色體核型分析［J］.河南科技大學學報（自然科學版）， 2016， 37（6）： 77-81.

18 段舒怡， 姜平， 李玉峰， 等. O型口蹄疫病毒VP1蛋白單克隆抗體的制備與生物學特性鑒定［J］. 中國人獸共患病學報， 2007，23（3）： 240-243.

19 李向茸， 馮若飛， 樊得英， 等. 腦心肌炎病毒單克隆抗體的制備與鑒定［J］. 中國獸醫(yī)雜志， 2014， 50（12）： 29-31.

20 錢興麗， 宋彩花， 任芳芳， 等. 人用疫苗生產(chǎn)用工作細胞庫Vero細胞的鑒別［J］. 中國生物制品學雜志， 2017， 30（10）： 1022-1027.

21 Liu NN， Zhang SL， Chen W. The cross-contaminated cell lines of adenoid cystic carcinoma： A crucial concern［J/OL］. https：//www.researchgate.net/publication/313833124_The_cross-contaminated_cell_lines_of_adenoid_cystic_carcinoma_A_crucial_concern.

22 Capes-Davis A， Theodosopoulos G， Atkin I， et al. Check your cultures! A list of cross-contaminated or misidentified cell lines［J］.Int J Cancer， 2010， 127（1）： 1-8.

23 Canny G. Cell line contamination and misidentification［J］. Biol Reprod， 2013， 89（3）： 76.

24 謝忠平， 李琦涵， 孫茂盛. 生物制品檢定手冊［M］. 北京： 化學工業(yè)出版社， 2008.

25 蘇強， 張曉延， 李婭亨， 等. 616名受試者染色體核型的分析［J］.中國婦幼保健， 2016， 31（7）： 1484-1486.

26 吳小青， 陳雪美， 謝曉蕊， 等. 原位培養(yǎng)載玻片法在流產(chǎn)絨毛染色體檢測中的應(yīng)用（附113例分析）［J］. 福建醫(yī)藥雜志， 2014，36（6）： 88-90.

27 劉愛生，朱春燕. 外周血淋巴細胞培養(yǎng)及染色體高分辨標本制備方法［J］. 中國優(yōu)生優(yōu)育， 2013，19（2）：82-85.

28 莊建龍， 王元白， 莊倩梅. 外周血染色體制備方法的探討［J］.國際檢驗醫(yī)學雜志， 2015， 36（17）： 2558-2560.

29 黃江玲， 林祥偉， 邱少雄， 等. 人外周血淋巴細胞培養(yǎng)及染色體制備的方法及成功率［J］. 中國校醫(yī)， 2015， 29（7）： 526-527.

30 張會勇， 王文鋒. 用細胞膜知識探討染色體制備過程中關(guān)鍵步驟的作用機理［J］. 生物技術(shù)世界， 2015（11）： 256.

31 Spurbeck JL， Zinsmeister AR， Meyer KJ， et al. Dynamics of chromosome spreading［J］. Am J Med Genet， 1996， 61（4）：387-393.

32 吳洪， 德吉巴卓， 商鵬， 等. 藏雞的有絲分裂觀察及染色體核型分析［J］. 中國畜牧獸醫(yī)， 2014， 41（1）： 174-177.

33 李軍， 趙金良 . 麻雀核型研究的新發(fā)現(xiàn)［J］. 遺傳， 1994， 16（2）：20-24.

34 程光潮， 吳麗. 家雞染色體的制備及其組型觀察［J］. 遺傳，1981， 3（1）： 17-19.

35 劉蓓一， 李國祥， 秦楓， 等. 固始雞核型、G帶的研究［J］. 中國家禽， 2006， 28（6）： 16-19.

36 曾養(yǎng)志. 家雞 （Gallus domesticus） 和原雞 （Gallus gallus） 的染色體及 G-帶帶型比較研究［J］. 云南農(nóng)業(yè)大學學報， 1987， 2（2）：57.

37 趙淑娟， 雷雪芹， 徐廷生， 等. 盧氏綠殼蛋雞染色體核型與G帶分析［J］. 西北農(nóng)林科技大學學報（自然科學版）， 2009， 37（12）：34-38.

38 嵇寶華， 湯道玲， 盧克倫. 中國地方雞種染色體研究進展［J］.上海畜牧獸醫(yī)通訊， 2004（5）： 4-5.

39 徐琪， 謝芳， 李碧春. 禽類染色體制備及其在育種中應(yīng)用［J］.動物科學與動物醫(yī)學， 2003， 20（2）： 13-15.