大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)和分化能力鑒定*

★周年 劉波 徐彭（1.江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 南昌 330004；2.江西省藥品檢驗檢測研究院 南昌 330029；3.江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心 南昌 330029；4.江西省中藥藥理學(xué)重點實驗室 南昌 330004）

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone mesenchymal stem cells，BMSCs）是存在于骨髓的間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs），有自我復(fù)制、更新及多向分化潛能的成體多能干細(xì)胞，在不同的誘導(dǎo)條件下分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等成熟的間質(zhì)細(xì)胞［1-3］，在骨病防治中有重要意義。目前主要采用全骨髓貼壁法、密度梯度離心法、細(xì)胞表面分子標(biāo)記分選法和細(xì)胞篩選法等方法進(jìn)行分離［4-5］，其中全骨髓貼壁法分離的細(xì)胞活性高，增殖能力強(qiáng)，但對于細(xì)胞骨向分化和脂向分化能力的明確評價并不清楚。因此，本研究主要采用全骨髓貼壁法獲取骨髓細(xì)胞P3代，考察其骨向分化和脂向分化能力，為骨病防治研究和組織工程研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF級雌性Sprague-Dawley（SD）大鼠，3月齡，體重150g左右，由湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司提供，許可證號：SCXK（湘）2013-0004，實驗過程中對動物的處置符合動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，室溫控制在20℃～22℃，恒濕，光照與環(huán)境一致，實驗期間自由飲水，實驗前12h禁食。3-異丁基-1-甲基黃嘌呤購于Sigma公司；4-硝基苯磷酸二鈉購于成都西亞試劑公司；Anti-Mouse/Rat CD29 FITC（E17759103）、Anti-Rat CD45 FITC（E17627102）、Anti-Mo/RatCD90.1（Thy1.1） PE（E013771631）、Anti-Rat CD11b/c PE（E15919105）均購于eBioscience公司；β-甘油磷酸鈉、胰島素、地塞米松、L-抗壞血酸、油紅O、茜素紅等均購于北京索萊寶科技有限公司，并配制骨向分化誘導(dǎo)液（β-甘油磷酸鈉、地塞米松、L-抗壞血酸）和脂向分化誘導(dǎo)液（地塞米松、胰島素、吲哚美辛、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤）。

1.2 方法

1.2.1 全骨髓貼壁法分離骨髓細(xì)胞及傳代培養(yǎng) 3月齡SD雌性大鼠脫臼處死，75%酒精浸泡10min，無菌條件下分離后肢的雙側(cè)脛骨及股骨，剔除周邊的肌肉、肌腱及結(jié)締組織，剪去兩端的骨骺端，充分暴露骨髓腔，以5mL注射器吸取LG-DMEM培養(yǎng)液反復(fù)沖洗骨髓腔至變白。收集骨髓懸液置于10mL離心管，低速離心1000rpm×5min，棄上清，以3mL新鮮含15%胎牛血清的LG-DMEM完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度以1×106cells/mL進(jìn)行接種，然后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶，并置于培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。72h首次半量更換培養(yǎng)基，更換培養(yǎng)基前，輕輕振蕩培養(yǎng)瓶3～4次，充分使非貼壁細(xì)胞通過更換培養(yǎng)基而清除，以后每4d全量更換培養(yǎng)基1次，同樣采取輕度振蕩篩選細(xì)胞，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)和生長情況，此時細(xì)胞即為骨髓P0代細(xì)胞，待細(xì)胞達(dá)到80%～90%融合，棄培養(yǎng)液，PBS清洗，以胰酶消化，進(jìn)行傳代擴(kuò)增，此時培養(yǎng)的細(xì)胞為骨髓P1代細(xì)胞，同樣方法，依次消化傳代并記作骨髓細(xì)胞P2～P3代等，最終取骨髓P3代細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞鑒定，以確定其分化功能適合作為種子細(xì)胞。

1.2.2 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定

1.2.2.1 形態(tài)學(xué)觀察 自原代培養(yǎng)開始通過顯微鏡下觀察大鼠骨髓細(xì)胞的形態(tài)。

1.2.2.2 骨髓細(xì)胞表面標(biāo)志物的鑒定 取P3代大鼠骨髓細(xì)胞，以不含EDTA的胰酶消化后，制成單細(xì)胞懸液，并調(diào)整細(xì)胞數(shù)為106～107/mL，以直接免疫熒光法針對細(xì)胞表面抗原檢測細(xì)胞免疫表型，用胎牛血清配制的FACS緩沖液1500rpm×3min，重懸洗滌后，各管分別加入CD29、CD45、CD11b/c、CD90.1等標(biāo)志物抗體及同型對照抗體，室溫避光孵育30min，PBS緩沖液洗滌離心3000rpm×3次，1%多聚甲醛固定，以流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.2.2.3 骨髓細(xì)胞骨向分化能力鑒定 取生長狀態(tài)良好的P3代骨髓細(xì)胞，以1×105cells/mL密度接種于24孔板中，實驗分為兩組，即對照組和誘導(dǎo)組，每組6個復(fù)孔，對照組正常換液，誘導(dǎo)組則加入骨向分化誘導(dǎo)液，每3d換液1次，光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。

堿性磷酸酶染色：經(jīng)骨向分化誘導(dǎo)液誘導(dǎo)12 d后取出培養(yǎng)板，以PBS沖洗，95%乙醇固定細(xì)胞10min，以改良鈣鈷法制備，光鏡下觀察。

堿性磷酸酶活力檢測（ρNPP法）：經(jīng)骨向分化誘導(dǎo)液誘導(dǎo)12d后取出培養(yǎng)板，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)基，PBS洗2遍，每孔加入細(xì)胞裂解液300μL（0.1%Triton X-100），4℃作用30min，收集裂解液采用對硝基酚磷酸鹽法測定堿性磷酸酶濃度，以ρNPP為底物，根據(jù)水解磷酸酯鍵所產(chǎn)生的對硝基酚基測定酶活力。

礦化結(jié)節(jié)染色：取出誘導(dǎo)21d的培養(yǎng)板，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)基，PBS清洗，95%乙醇固定20min，以0.1%茜素紅染色，光鏡下觀察。

1.2.2.4 細(xì)胞脂向分化能力鑒定 取生長狀態(tài)良好的P3代骨髓細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105cells/mL接種24孔培養(yǎng)板上。實驗分為兩組，即對照組和誘導(dǎo)組，每組6個復(fù)孔，對照組正常換液，誘導(dǎo)組則加入脂向分化誘導(dǎo)液，每3d換液1次，光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

油紅O染色：誘導(dǎo)12d后取出孔板，PBS清洗，95%乙醇固定10min，PBS清洗1遍，60%異丙醇濕潤2min，吸出異丙醇后加入已過濾好的油紅O工作液染色15min；60%異丙醇分色至背景無色，光鏡下觀察。

油紅O染液半定量法：利用異丙醇充分溶解油紅O染液，520nm處檢測胞內(nèi)殘留染液的吸光度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 數(shù)據(jù)均用表示，SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行One-way ANOVA檢驗比較多組數(shù)據(jù)間差異顯著性，P＜0.05為差異具有顯著性，P＜0.01為差異具有極顯著性。

2 結(jié)果

2.1 大鼠骨髓細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察 原代培養(yǎng)時，全骨髓貼壁法分離的骨髓細(xì)胞呈圓形，胞體透亮，大小不一，與周圍的紅細(xì)胞等血系細(xì)胞相互混雜。72h半量換液后可見大量貼壁細(xì)胞，6～7d貼壁分裂細(xì)胞形成不同大小、分散的細(xì)胞集落，9～10d細(xì)胞逐漸融合成片，相互緊密貼附生長。細(xì)胞消化傳代至第3代，可見細(xì)胞呈均勻分布的紡錘形平均生長，呈典型的漩渦狀生長，見圖1。

圖1 細(xì)胞形態(tài)觀察（×100）

2.2 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物的鑒定 流式細(xì)胞法檢測發(fā)現(xiàn)，P3代細(xì)胞CD90、CD29陽性表達(dá)率分別為96.4%和78.5%，而CD45、CD11b/c陽性比率分別為2.0%和1.9%，見圖2。由于CD90和CD29為間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物，CD45、CD11b/c為造血系細(xì)胞表面標(biāo)志物，結(jié)果表明，P3骨髓細(xì)胞絕大多數(shù)為大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。

圖2 流式細(xì)胞儀鑒定P3骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

2.3 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化能力鑒定

2.3.1 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞骨向分化能力鑒定 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)骨向誘導(dǎo)后形態(tài)由原來的紡錘形逐漸轉(zhuǎn)化為多角形、方形等，較對照組細(xì)胞體積更大，細(xì)胞外基質(zhì)分泌逐漸增多，胞外可見許多黑色細(xì)小顆粒（見圖3）。骨向誘導(dǎo)12d后以改良鈣鈷法進(jìn)行堿性磷酸酶染色，胞漿內(nèi)呈現(xiàn)深棕色或深黑色顆粒狀或大片狀黑色沉淀（見圖4），同時堿性磷酸酶活力明顯升高（P＜0.05，見圖5）；骨向誘導(dǎo)21d后運用茜素紅進(jìn)行礦化結(jié)節(jié)染色，光鏡下誘導(dǎo)組可見細(xì)胞融合重疊生長，形成明顯的紅色致密結(jié)節(jié)，周圍呈放射狀突起，表明細(xì)胞形成礦化結(jié)節(jié)（見圖6）。

圖3 P3大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞骨向誘導(dǎo)形態(tài)觀察（×200）

圖4 P3大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞骨向誘導(dǎo)12d堿性磷酸酶染色（×100）

圖5 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞骨向誘導(dǎo)堿性磷酸酶活力

圖6 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞骨向誘導(dǎo)礦化結(jié)節(jié)染色（×100）

2.3.2 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞脂向分化能力鑒定 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)脂向誘導(dǎo)后形態(tài)逐漸由梭形變?yōu)閳A形、多角形等，誘導(dǎo)前期可見折光性強(qiáng)的圓形小脂滴，后期小脂滴逐漸增多融合成大脂滴，并將細(xì)胞核擠于一側(cè)，脂向誘導(dǎo)12d后用油紅O染色顯示脂滴呈紅色（見圖7），同時利用異丙醇充分溶解油紅O染液的原理，對殘留染液進(jìn)行了半定量檢測。脂向誘導(dǎo)組較對照組明顯升高OD值，具有極顯著性差異（P＜0.01，見圖8）。

圖7 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞脂向誘導(dǎo)倒置顯微鏡下觀察（×200）

圖8 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞脂向分化脂質(zhì)累積值

3 討論

MSCs是一種起源于中胚層，在體外不同的誘導(dǎo)條件下分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、心肌細(xì)胞等成熟的間質(zhì)細(xì)胞，在骨髓最為常見，研究得最深入，目前主要采用全骨髓貼壁法進(jìn)行分離培養(yǎng)［6-8］。但對于分離的骨髓細(xì)胞目前并沒有單一的特異性的方法來鑒定BMSCs。本研究采用全骨髓貼壁法進(jìn)行分離培養(yǎng)骨髓細(xì)胞，傳代過程中充分利用細(xì)胞輕度振蕩來清除不貼壁細(xì)胞，提高細(xì)胞純度。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞傳至第3代，細(xì)胞在顯微鏡下可見紡錘形生長，呈典型漩渦狀。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)CD90與CD29的陽性細(xì)胞比率分別為96.4%和78.5%；CD45和CD11b/c的陽性細(xì)胞比率分別為2.0%和1.9%，與文獻(xiàn)報道一致［9-11］，同時加入經(jīng)典骨向誘導(dǎo)劑和脂向誘導(dǎo)劑，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外基質(zhì)分泌增多，較對照組細(xì)胞胞漿內(nèi)可見明顯的深棕色或大片狀黑色沉淀，顯著升高ALP活力，且可見明顯的紅色致密結(jié)節(jié)，周圍呈放射狀突起，表明細(xì)胞聚集生長，逐漸形成礦化結(jié)節(jié)，充分表明BMSCs成功分化成了成骨細(xì)胞。在脂向誘導(dǎo)劑組初期可見折光性強(qiáng)的圓形小脂滴，經(jīng)油紅O染色后，誘導(dǎo)組可見被染成紅色的脂滴，采用異丙醇溶解油紅O染液半定量檢測，顯示脂向誘導(dǎo)組OD值明顯升高，進(jìn)一步確定MSCs成功分化為脂肪細(xì)胞。這些結(jié)果一定程度上與國際社會公認(rèn)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞依據(jù)相符，即細(xì)胞的貼附特性、細(xì)胞標(biāo)志物CD90，CD45等的表達(dá)和能否分化為成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞等。

綜合形態(tài)學(xué)、細(xì)胞表面標(biāo)志物及骨向分化和脂向分化誘導(dǎo)BMSCs結(jié)果，顯示全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)骨髓細(xì)胞，充分利用細(xì)胞輕度振蕩，培養(yǎng)至P3代的BMSCs具有骨向分化和脂向分化能力，可用于骨病防治研究和骨組織工程研究。

參考文獻(xiàn)

［1］張穎,郭建華,閆洪娟,等.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療老年性癡呆模型大鼠的行為學(xué)檢測[J].中國組織工程研究, 2016, 20(36):5 371-5 377.

［2］傅淑平,楊麗,洪浩,等.淫羊藿苷促SD 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞骨向分化作用的實驗研究[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志, 2015, 35(7):839-846.

［3］祝旭龍,顏譚,姚偉杰,等.大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離與培養(yǎng)方法優(yōu)化[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報, 2014, 34(11):1 621-1 626.

［4］宮宇,王鴻飛,夏海軍. 全骨髓貼壁接觸培養(yǎng)SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞[J].中國組織工程研究, 2014, 18(1):51-56.

［5］司徒鎮(zhèn)強(qiáng),吳軍正.細(xì)胞培養(yǎng)[M].西安:世界圖書出版社, 2004:177.

［6］李曉峰,趙勁民,蘇偉,等.大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù), 2011, 15(10):1 721-1 725.

［7］蔡鵬,朱紹興,蘇一鳴,等.全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及其誘導(dǎo)分化[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù), 2009,13(36):7 073-7 077.

［8］曹華,高建華,劉小龍,等.大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離鑒定方法及生物學(xué)特性[J].中國組織工程研究, 2017, 21(9):1 357-1 362.

［9］Anokhina EB, Buravkova LB. Heterogeneity of stromal precursor cells isolated from rat bone marrow [J]. Tsitologiia, 2007, 49(1):40-47.

［10］Yoshimura H, Muneta T, Nimura A, et al. Comparison of rat mesenchymal stem cells derived from bone marrow, synovium, periosteum, adipose tissue, and muscle [J]. Cell Tissue Res, 2007, 327(3):449-462.

［11］Li X, Yu X, Lin Q, et al. Bone marrow mesenchymal stem cells differentiate into functional cardiac phenotypes by cardiac microenvironment [J]. J Mol Cell Cardio, 2007, 42(2):295-303.