歸芪聰志湯對(duì)血管性癡呆大鼠海馬缺氧誘導(dǎo)因子-1α、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和血紅素加氧酶-1表達(dá)的影響

張 宣 吳紅彥 李海龍 陳 杰 馬春林

(甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000)

癡呆是由多種原因?qū)е轮橇δ苷系K的一種臨床綜合征，其中阿爾茨海默病(AD)和血管性癡呆(VD)最為常見(jiàn)，而就目前的臨床就診人群研究結(jié)果證明VD高于AD〔1〕。由于臨床確診VD時(shí)多為疾病晚期，目前也無(wú)特效的治療藥物，近年來(lái)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)中醫(yī)藥治療可有效改善患者認(rèn)知功能和行為能力等，并且具有療效滿意、副作用少等眾多優(yōu)勢(shì)，合理開(kāi)發(fā)中醫(yī)藥治療癡呆逐漸受到醫(yī)學(xué)研究者的青睞〔2〕。前期臨床研究表明歸芪聰志湯對(duì)于改善VD患者癥狀有較好療效，為進(jìn)一步探討其作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)雙側(cè)頸動(dòng)脈結(jié)扎法建立VD大鼠模型，觀察歸芪聰志湯對(duì)VD大鼠海馬組織血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α和血紅素加氧酶(HO)-1表達(dá)的影響。

1 資料與方法

1.1動(dòng)物與分組 SPF級(jí)Wistar雌性大鼠，體重(200±20)g，由甘肅中醫(yī)學(xué)院科研實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SYXK(甘)2011-0001。造模前經(jīng)過(guò)Morris水迷宮測(cè)試篩選淘汰不合格大鼠后，留取84只健康大鼠；采用隨機(jī)對(duì)照法，將大鼠分為假手術(shù)組、模型組、歸芪聰志湯高劑量組、歸芪聰志湯中劑量組、歸芪聰志湯低劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)中各組鼠均有缺失。

1.2主要儀器與試劑 Morris水迷宮視頻跟蹤分析系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)；兔抗VEGF多克隆抗體(批號(hào)：AD090110)、兔抗HO-1多克隆抗體(批號(hào)：AD082653)、兔抗HIF-1多克隆抗體(批號(hào)：AD072912)、兔抗CD34多克隆抗體(批號(hào)：140616)，兔SP檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：15121A01)，購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；RT-PCR試劑盒(批號(hào)：1418J)，Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit(批號(hào)：10274023)，β-actin(批號(hào)：AB10KA4661)，由蘭州瑞真生物技術(shù)有限公司提供。VEGF正義鏈引物：5′CCAGGATTTAAACCGGGATTTC3′，反義鏈引物：5′TCCTGCAGCATAGCAGATGTGA3′，125 bp；HIF-1α正義鏈引物：5′GCTGTCCACATCAAAGCAGTACTCA3′，反義鏈引物：5′CCAGATTCAAGATCAGCCAGCA3′，100 bp；HO-1正義鏈引物：5′CTTCCAGGGCCGTATAGATATGGTA3′，反義鏈引物：5′AGGTGCACATCCGTGCAGAG3′，120 bp。

1.3藥物 歸芪聰志湯由黃芪30 g、當(dāng)歸30 g、川芎15 g、石菖蒲15 g、苦參15 g等組成，購(gòu)自甘肅中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院。藥物以總體積的8倍量水冷浸3 h，微沸1 h，煎煮2次后合并濾液制成濃度分別為0.66 g、1.32 g、2.64 g生藥/ml的水提液，無(wú)菌條件裝瓶；吡拉西坦膠囊(0.25 g×48片，西安利君方圓制藥有限責(zé)任公司)，用生理鹽水配成30 mg/ml的混懸液，4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.4方法

1.4.1動(dòng)物模型制作 采用改良后的大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久性結(jié)扎法〔3〕。大鼠術(shù)前12 h禁食，不禁水，用10%水合氯醛(300 mg/kg)麻醉。大鼠麻醉后，將其仰臥固定在手術(shù)臺(tái)，頸前部手術(shù)區(qū)域去毛，碘酒消毒，頸部正中切開(kāi)皮膚及皮下組織，取頸前正中切口，鈍性分離皮下結(jié)締組織、頸前肌群，仔細(xì)分離暴露左側(cè)CCA，以“0”號(hào)絲線結(jié)扎左側(cè)CCA的近端及遠(yuǎn)端，并從中間剪斷，以徹底阻斷CCA血流，連續(xù)3 d慶大霉素肌肉注射，預(yù)防感染，最后逐層縫合皮下結(jié)締組織、皮膚。1 w后再結(jié)扎右側(cè)CCA，操作方法同第1次。假手術(shù)組僅分離暴露雙側(cè)CCA而不結(jié)扎。

1.4.2給藥及取材方法 歸芪聰志湯按高、中、低劑量灌胃給藥，陽(yáng)性對(duì)照組給予吡拉西坦，假手術(shù)組、模型組給予等量生理鹽水，劑量1.5 ml/100 g，1次/d，連續(xù)灌胃治療28 d。大鼠麻醉后經(jīng)心臟灌注內(nèi)固定取腦，取大鼠腦最寬部位(海馬冠狀位)約4 mm。

1.4.3動(dòng)物模型成功的判斷 術(shù)后7 d行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，連續(xù)訓(xùn)練5 d，每次2 min，第3天開(kāi)始記錄，取假手術(shù)組大鼠逃避潛伏期的均值為參考值，同時(shí)計(jì)算模型組大鼠平均逃避潛伏期與參考值之差占該鼠的平均逃避潛伏期的比值，該值>20%定為癡呆鼠〔4〕。

1.4.4大鼠學(xué)習(xí)記憶能力測(cè)試 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)：第1天讓大鼠自由游泳120 s。第2天開(kāi)始正式對(duì)大鼠進(jìn)行Morris水迷宮測(cè)試。將大鼠面向池壁放入水中，每天測(cè)試1次，每只每次測(cè)試120 s，連續(xù)5 d，記錄大鼠尋找并爬上平臺(tái)所需時(shí)間(逃避潛伏期)。在測(cè)試第6天，撤除水下平臺(tái)，讓大鼠在無(wú)平臺(tái)情況下尋找記憶平臺(tái)。隨機(jī)選取一入水點(diǎn)，將大鼠面向池壁放入水中，每只大鼠限時(shí)游120 s，記錄其在120 s內(nèi)游過(guò)原平臺(tái)相應(yīng)位置的次數(shù)。

1.4.5病理組織學(xué)檢查 每組隨機(jī)抽取6只大鼠的海馬進(jìn)行石蠟切片，常規(guī)脫蠟、乙醇梯度脫水、蘇木素-伊紅染色，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。應(yīng)用SP法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。其中兔抗VEGF、HIF-1α、HO-1的工作濃度分別為1∶100、1∶200、1∶100。光鏡下觀察結(jié)果，細(xì)胞質(zhì)、胞核染成棕黃色或棕褐色為陽(yáng)性細(xì)胞。每張片子在400倍下隨機(jī)選5個(gè)視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野下的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目，取平均值，各組免疫組化結(jié)果應(yīng)用Leica Qwin病理圖像分析系統(tǒng)處理。

1.4.6實(shí)時(shí)熒光定量PCR 將凍存的大鼠海馬組織進(jìn)行稱重，50～100 mg，加200 μl的Trizol液，研磨充分后再加入剩下的800 μl Trizol液，混勻，室溫放置5 min；4℃，12 000 r/min，離心5 min，吸出上清液到新的EP管，加入200 μl氯仿，用力震蕩15 s，放置3 min；4℃，12 000 r/min，離心15 min，取上清液加500 μl異丙醇，混勻，放置10 min，4℃，12 000 r/min，離心10 min，棄去上清液；用75%的乙醇清洗沉淀2次，4℃，7 500 r/min，離心5 min，風(fēng)干后用DEPC水溶解，并測(cè)OD值；分裝后-80℃保存。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，布板，然后利用熒光定量PCR軟件進(jìn)行分析，觀察擴(kuò)增曲線。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組學(xué)習(xí)記憶能力比較 與假手術(shù)組比較，模型組逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)，跨原平臺(tái)次數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，歸芪聰志湯中劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組大鼠逃避潛伏期明顯縮短，跨原平臺(tái)次數(shù)明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中歸芪聰志湯中劑量組明顯優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組逃避潛伏期、跨原平臺(tái)次數(shù)比較

與假手術(shù)組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05；與陽(yáng)性對(duì)照組比較：3)P<0.05，下表同

圖1 各組海馬神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)(HE，×400)

2.2各組海馬神經(jīng)元形態(tài)結(jié)果比較 見(jiàn)圖1。假手術(shù)組海馬區(qū)組織結(jié)構(gòu)完整，神經(jīng)元數(shù)目和形態(tài)正常，排列整齊，神經(jīng)元樹(shù)突正常，分支較多，細(xì)胞核大而圓，核仁清晰，HE染色均勻。模型組海馬區(qū)神經(jīng)元大部分變性壞死，數(shù)目顯著減少，排列紊亂，神經(jīng)元樹(shù)突大量缺失，分支較少，細(xì)胞核固縮、深染，核仁消失。與模型組相比，歸芪聰志湯各劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組神經(jīng)元損傷減輕，神經(jīng)元數(shù)目及其樹(shù)突增多，細(xì)胞核固縮現(xiàn)象減輕，其中歸芪聰志湯中劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組較歸芪聰志湯高、低劑量組神經(jīng)元更加完整。

2.3各組海馬組織HIF-1α、VEGF、HO-1蛋白表達(dá)比較 與假手術(shù)組比較，模型組HIF-1α、VEGF和HO-1的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)表達(dá)均明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，各治療組HIF-1α、VEGF和HO-1的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)表達(dá)均增多，其中歸芪聰志湯中劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，歸芪聰志湯中劑量組HIF-1α、VEGF和HO-1的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)表達(dá)均顯著增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2，圖2、圖3、圖4。

表2 各組海馬組織HIF-1α、VEGF、HO-1蛋白表達(dá)比較(每高倍鏡下陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)，

圖2 各組海馬組織HIF-1α蛋白表達(dá)比較(DAB，×400)

圖3 各組海馬組織VEGF蛋白表達(dá)比較(DAB，×400)

圖4 各組海馬組織HO-1蛋白表達(dá)比較(DAB，×400)

2.4各組海馬組織HIF-1α、VEGF、HO-1 mRNA表達(dá)比較 與假手術(shù)組比較，模型組HIF-1α、VEGF、HO-1 mRNA表達(dá)量均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，歸芪聰志湯高劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組HIF-1α、VEGF、HO-1 mRNA表達(dá)量均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 各組海馬組織HIF-1α、VEGF、HO-1 mRNA表達(dá)比較

3 討 論

腦血管疾病導(dǎo)致的腦組織缺血缺氧是VD的主要病因〔5〕。低氧環(huán)境下，機(jī)體會(huì)產(chǎn)生一系列適應(yīng)反應(yīng)以維持氧穩(wěn)態(tài)，而HIF-1是氧分壓的主傳感器，其中HIF-1α是直接感受缺氧的感受器〔6〕。HIF-1α通過(guò)調(diào)控靶基因的表達(dá)激活相關(guān)信號(hào)通路使機(jī)體對(duì)缺氧的耐受及維持體內(nèi)穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著重要作用。目前已知的受HIF-1α調(diào)控的靶基因有130余種，其中對(duì)VEGF的調(diào)控尤為重要〔7〕，VEGF是由細(xì)胞產(chǎn)生的能刺激新生血管形成的化學(xué)因子，而血管生成又保護(hù)了殘存的神經(jīng)細(xì)胞，并對(duì)學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的要害部位皮層、海馬、小腦的各種神經(jīng)細(xì)胞發(fā)揮直接的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)性效應(yīng)和神經(jīng)再生作用〔8〕。Manoonkitiwongsa等〔9〕還發(fā)現(xiàn)VEGF具有獨(dú)立于血管形成之外的神經(jīng)保護(hù)作用。另外，HIF-1α的靶基因HO-1是血紅素分解代謝過(guò)程中的限速酶，它可以使血紅素分解代謝產(chǎn)生一氧化碳(CO)、膽綠素(迅速轉(zhuǎn)變?yōu)槟懠t素和游離鐵)、鐵結(jié)合蛋白〔10〕，適量的CO在存在于腦組織中，能使血管擴(kuò)張、抑制血小板的聚集、減少脂質(zhì)過(guò)氧化和蛋白質(zhì)氧化，從而發(fā)揮其細(xì)胞保護(hù)作用，而生理濃度范圍內(nèi)的膽紅素和膽綠素是體內(nèi)強(qiáng)有力的抗氧化劑〔11〕，并有研究發(fā)現(xiàn)海馬注射重組腺相關(guān)病毒介導(dǎo)HO-1基因，可增加慢性缺血大鼠海馬組織超氧化物歧化酶活性，降低丙二醛、一氧化氮含量，減少氧化應(yīng)激損傷〔12〕。本研究表明歸芪聰志湯治療VD的機(jī)制可能與促進(jìn)HIF-1α、VEGF、HO-1的表達(dá)相關(guān)，也可能與促進(jìn)HIF-1α的表達(dá)，從而激活其靶基因VEGF、HO-1，最終激發(fā)腦內(nèi)的神經(jīng)修復(fù)機(jī)制相關(guān)。

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