端粒結(jié)合蛋白Rap1促進(jìn)化療藥物誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞衰老相關(guān)分泌表型

姚婷婷 王靜云 陸文全 呂 帥 李 昕 寧寒冰

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，河南 鄭州 450052)

衰老細(xì)胞分泌炎癥細(xì)胞因子、趨化因子、生長因子和蛋白酶等，稱為細(xì)胞衰老相關(guān)分泌表型(SASP)〔1〕。治療(包括化療、放療等)誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞SASP(TIS)促進(jìn)腫瘤發(fā)展、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、耐藥及化療藥物引起的短期和長期副作用〔2〕。端粒是位于染色體末端的DNA-蛋白結(jié)構(gòu)，由TTAGGG重復(fù)序列和大量的端粒結(jié)合蛋白組成。6個端粒結(jié)合蛋白TRF1、TRF2、Rap1、POT1、TIN2 和TPP1組成Shelterin復(fù)合體〔3〕。研究證明端粒結(jié)合蛋白在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用〔4〕。Rap1是Shelterin復(fù)合體中一個特殊的因子，研究顯示哺乳動物Rap1至少擁有3種獨(dú)特的功能：端粒功能；轉(zhuǎn)錄調(diào)控；在胞質(zhì)抑制核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB信號通路〔5〕。在釀酒酵母衰老過程中，Rap1離開端粒并重新定位于數(shù)百個新靶基因的上游啟動子區(qū)域，促進(jìn)衰老相關(guān)基因表達(dá)，推動衰老進(jìn)程〔6〕；在皮膚成纖維細(xì)胞衰老和氧化應(yīng)激時(shí)，Rap1水平下降〔7〕。研究顯示：依托泊苷(etoposide)或阿霉素(ADR)誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞Rap1表達(dá)增高，藥物誘導(dǎo)的Rap1表達(dá)升高通過參與DNA損傷修復(fù)，促進(jìn)胃癌細(xì)胞多藥耐藥〔8〕。本研究探討端粒結(jié)合蛋白Rap1在化療藥物誘導(dǎo)的胃癌SASP中的作用。

1 材料和方法

1.1細(xì)胞和試劑 人胃癌細(xì)胞系SGC7901來源于第四軍醫(yī)大學(xué)西京消化病醫(yī)院腫瘤生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。細(xì)胞生長于含10%滅活小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)。etoposide購自Sigma-Aldrich?？贵w：抗Rap1(Abcam，ab14404)，抗p16INK4a(Abcam，ab16123)，抗p53(Cell Signaling，9282)，抗白細(xì)胞介素(IL)-1A(Abcam，ab9614)，抗IL-6(Abcam，ab9324)，抗IL-8(Abcam，ab7747)，抗血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)-A(Abcam，ab51745)，抗干擾素(IFN)-γ(Cell Signaling，3F1E3)，抗γ-tubulin (Abcam，ab11316)。

1.2誘導(dǎo)細(xì)胞衰老 1×106個細(xì)胞接種于直徑10 cm的培養(yǎng)皿，37℃培養(yǎng)過夜；將培養(yǎng)液更換為低血清2%FBS，分別加入空白培養(yǎng)液(對照組)和5 μmol/L etoposide(試驗(yàn)組)，處理1、5、7、9 d，每3 d更換含有vehicle或5 μmol/L etoposide的新鮮培養(yǎng)液。收集條件培養(yǎng)液時(shí)，更換為新鮮不含藥物培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.3β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色 根據(jù)衰老細(xì)胞組織化學(xué)染色試劑盒(Sigma-Aldrich)說明書進(jìn)行SA-β-Gal染色，顯微鏡下觀察細(xì)胞SA-β-Gal染色。

1.4AlamarBlue檢測 細(xì)胞生長曲線采用AlamarBlue分析(Life Technologies)。細(xì)胞按照1 × 104/孔接種于96孔板，37℃培養(yǎng)過夜。vehicle或5 μmol/L etoposide處理后，加入AlamarBlue試劑，37℃繼續(xù)培養(yǎng)2 h，檢測570 nm吸光值(A)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，細(xì)胞活力=(實(shí)驗(yàn)組A值-空白對照組A值)/(陰性對照組A值-空白對照組A值)×100%。

1.5Western印跡檢測 裂解細(xì)胞提取總蛋白，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，應(yīng)用電轉(zhuǎn)移將電泳分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜上，濾膜經(jīng)5%脫脂奶粉于室溫封閉后，依次與一抗及辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗孵育，以電化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯色。

1.6RT-PCR RNeasy試劑盒(Qiagen)提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Roche)合成cDNA，RT-PCR采用Roche公司LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I System，將GAPDH設(shè)為內(nèi)參。引物見表1。

表1 Real-time PCR引物列表

1.7酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測 收集不同細(xì)胞條件培養(yǎng)液，根據(jù)Human Quantikine ELISA試劑合(R&D Systems)說明書檢測IL-1A、IL-6、IL-8、VEGF、IFN-γ表達(dá)，結(jié)果表示為與陰性對照組檢測值的比值。

1.8轉(zhuǎn)染 前期實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的Rap1 siRNA和陰性對照siRNA載體〔8〕采用LipofectamineTM2000(Invitrogen)分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染SGC7901細(xì)胞(分別命名為SGC7901-Rap1 KD和SGC7901-NC)，SGC7901-Rap1 KD分別用空白培養(yǎng)液及5 μmol/L etoposide 處理1、5、7、9 d(分別為Rap1 KD對照組及Rap1 KD試驗(yàn)組)，SGC7901-NC分別用空白培養(yǎng)液及5 μmol/L etoposide 處理1、5、7、9 d(分別為NC對照組及NC試驗(yàn)組)。4組檢測指標(biāo)及方法同對照組及實(shí)驗(yàn)組。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS21.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1兩組細(xì)胞增殖情況及Rap1、SASP相關(guān)因子表達(dá)比較 試驗(yàn)組第3天后細(xì)胞停止生長，見表2。與對照組比較，試驗(yàn)組第5天細(xì)胞SA-β-Gal染色增加，p53及p16INK4a蛋白表達(dá)升高，見圖1、圖2。與對照組比較，試驗(yàn)組第1、5、7、9 d Rap1 mRNA顯著升高(P<0.001), 第5、7、9天SASP相關(guān)因子(IL-1A、IL-6、IL-8、VEGF-A、IFN-γ mRNA均顯著升高(P<0.05，P<0.001)。與對照組比較，試驗(yàn)組細(xì)胞條件培養(yǎng)液中第5、7、9天IL-1A、IL-6、IL-8 mRNA均顯著升高(P<0.05，P<0.001)，第7、9天VEGF-A、IFN-γ mRNA均顯著升高(P<0.05)。見表3、表4。

圖1 兩組SGC7901細(xì)胞第5天SA-β-Gal染色(×400)

圖2 兩組培養(yǎng)第5天p53及P16INK4a表達(dá)

圖3 兩組Rap1和SASP相關(guān)因子蛋白表達(dá)

組別第0天第1天第2天第3天第4天第5天第6天第7天對照組1．00±0．741．14±0．031．93±0．203．51±0．245．33±0．226．25±0．196．80±0．266．80±0．08試驗(yàn)組1．00±0．051．89±0．081．47±0．111．60±0．101)1．60±0．091)1．60±0．201)1．49±0．131)1．52±0．231)

與對照組比較：1)P<0.05

表3 兩組Rap1和SASP相關(guān)因子mRNA表達(dá)比較

與對照組比較：1)P<0.05，2)P<0.001;下表同

表4 兩組細(xì)胞條件培養(yǎng)液中SASP相關(guān)因子表達(dá)比較

2.24組細(xì)胞增殖情況及Rap1 mRNA、p53、p16INK4a表達(dá)比較 Rap1 KD對照組、Rap1 KD試驗(yàn)組、NC對照組及NC試驗(yàn)組Rap1 mRNA表達(dá)相對密度分別為0.43±0.04、0.64±0.05、1.17±0.02、4.13±0.19，Rap1 KD對照組與NC對照組、Rap1 KD試驗(yàn)組與NC試驗(yàn)組比較Rap1 mRNA表達(dá)相對密度均顯著降低(P<0.05)，見圖4。Rap1 KD試驗(yàn)組及NC試驗(yàn)組第3天后細(xì)胞均停止生長，見表5。NC試驗(yàn)組與NC對照組比較、Rap1 KD試驗(yàn)組與Rap1 KD對照組比較，第5天細(xì)胞SA-β-Gal染色增加，p53及p16INK4a蛋白表達(dá)顯著升高，見圖5、圖6。

1:Rap1 KD對照組，2：Rap1 KD試驗(yàn)組，3：NC對照組，4：NC試驗(yàn)組圖4 4組Rap1蛋白表達(dá)

2.3Rap1敲除抑制SASP表達(dá) 與NC試驗(yàn)組比較，Rap1 KD試驗(yàn)組第5天IL-1A、IL-6、IL-8、VEGF-A、IFN-γ mRNA均顯著降低(P<0.05，P<0.001)。與NC試驗(yàn)組比較，Rap1 KD試驗(yàn)組細(xì)胞條件培養(yǎng)液中第5、7、9天IL-1A、IL-6、IL-8 VEGF-A、IFN-γ mRNA均顯著升高(P<0.05，P<0.001)。見圖7、表6。

圖5 4組細(xì)胞第5天SA-β-Gal染色(×400)

組別第0天第1天第2天第3天第4天第5天第6天第7天NC對照組1．00±0．112．64±0．195．01±0．876．61±0．428．43±0．3210．04±0．5810．43±0．4510．49±0．83Rap1KD對照組1．00±0．192．64±0．344．10±0．275．43±0．157．55±0．459．08±0．439．51±0．469．45±0．54NC試驗(yàn)組1．00±0．082．03±0．772．64±1．053．12±1．071)3．26±1．081)3．35±0．661)3．28±0．331)3．21±0．831)Rap1KD試驗(yàn)組1．00±0．302．44±0．263．09±0．333．39±0．322)3．94±0．492)3．90±0．302)4．15±0．672)4．05±0．592)

與NC對照組比較：1)P<0.05; 與Rap1 KD對照組比較：2)P<0.05

表6 NC試驗(yàn)組及Rap1 KD試驗(yàn)組細(xì)胞條件培養(yǎng)液中SASP相關(guān)因子表達(dá)比較

與NC試驗(yàn)組比較：1)P<0.05，2)P<0.001

1:Rap1 KD對照組，2：Rap1 KD試驗(yàn)組，3：NC對照組，4：NC試驗(yàn)組圖6 4組p56、p16INK4a蛋白表達(dá)

圖7 Rap1 KD試驗(yàn)組及NC試驗(yàn)組Rap1和SASP相關(guān)因子蛋白表達(dá)

3 討 論

TIS在腫瘤治療中發(fā)揮著復(fù)雜的“雙刃劍”式作用，一方面細(xì)胞處于生長停滯狀態(tài)，抑制細(xì)胞增殖，并通過SASP相關(guān)因子促進(jìn)免疫清除〔9〕；另一方面，證據(jù)證實(shí)：TIS誘發(fā)局部和全身性炎癥，促進(jìn)化療藥物引起的短期和長期副作用，包括骨髓抑制、心臟損傷、腫瘤復(fù)發(fā)、衰竭等〔10〕。此外，TIS促進(jìn)腫瘤耐藥，通過誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)和增加腫瘤細(xì)胞侵襲力促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移〔11〕。

Rap1是具有多種端粒和端粒外功能的調(diào)控蛋白，與衰老和腫瘤發(fā)展密切相關(guān)。在乳腺癌和肝癌中發(fā)現(xiàn)Rap1表達(dá)升高，抑制細(xì)胞凋亡，增加腫瘤侵襲性〔12〕。Rap1結(jié)合于染色體的某些非端粒位點(diǎn)，調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附因子、腫瘤及代謝等相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄。Rap1通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控和NF-κB信號通路調(diào)節(jié)炎性因子表達(dá)，抑制Rap1降低間充質(zhì)干細(xì)胞腫瘤壞死因子(TNF)-α、IL-6和單核細(xì)胞趨化蛋白-1的分泌，提高細(xì)胞存活及在心肌梗死中的治療效果；Rap1促進(jìn)NLRP3炎性小體，導(dǎo)致移植肝臟損傷〔13〕；Rap1促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌炎性因子，促進(jìn)動脈粥樣硬化發(fā)展〔14〕。研究顯示，胞質(zhì)Rap1和胞核NF-κB p65在胃癌組織中的表達(dá)呈顯著正相關(guān)，可能與NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路共同參與胃癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)〔15〕；Rap1調(diào)控TRF2在化療藥物誘導(dǎo)的DNA損傷修復(fù)中的作用，參與胃癌耐藥的發(fā)生〔8〕。而DNA損傷反應(yīng)和NF-κB信號通路都是SASP調(diào)控因子〔16〕，本研究進(jìn)一步證實(shí)，Rap1調(diào)控化療藥物誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞SASP。在低劑量etoposide誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞衰老過程中伴隨Rap1表達(dá)升高，Rap1表達(dá)升高出現(xiàn)于etoposide處理的早期階段，并在衰老細(xì)胞中持續(xù)存在；Rap1敲除不影響etoposide誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老，但抑制并延遲SASP表達(dá)。因此，Rap1可能通過調(diào)控TIS促進(jìn)胃癌發(fā)展及耐藥，抑制Rap1將為胃癌治療提供新的靶點(diǎn)。

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