亮氨酸對(duì)早期斷奶仔豬肝中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響

樊啟文，陳伶俐，趙麗，石敏，晏向華*1

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院/農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢430070；2.生豬健康養(yǎng)殖湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，武漢430070；3.生豬精準(zhǔn)飼養(yǎng)與飼料安全技術(shù)湖北省工程實(shí)驗(yàn)室，武漢430070）

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)分泌蛋白和跨膜蛋白折疊和成熟的主要場(chǎng)所，它對(duì)蛋白質(zhì)的加工過(guò)程依賴其內(nèi)腔中的多種蛋白酶[1]。當(dāng)流入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)腔中的未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白超過(guò)其自身處理能力而出現(xiàn)大量積累時(shí)，會(huì)導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生。未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response,UPR）是細(xì)胞內(nèi)應(yīng)對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的關(guān)鍵性細(xì)胞信號(hào)通路，主要通過(guò)減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中蛋白質(zhì)的流入及增強(qiáng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的處理能力，從而維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的穩(wěn)定[1]。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能障礙不能通過(guò)調(diào)節(jié)恢復(fù)時(shí)，UPR也能夠啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序以保證機(jī)體免受未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白的侵害[2-3]。

UPR能夠介導(dǎo)位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的3種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激感受器的激活，包括：活化轉(zhuǎn)錄因子6（activating transcription factor-6,ATF6），雙鏈RNA活化蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（protein kinase RNA-like ER kinase,PERK）和肌醇依賴性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)至細(xì)胞核信號(hào)激酶1（inositol-requiring ER-to-nucleus signal kinase-1,IRE1）[4-6]。作為一種Ⅱ型跨膜蛋白，ATF6能夠被蛋白水解酶激活形成一種可溶性的轉(zhuǎn)錄因子，并轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核中發(fā)揮作用[7]。PERK蛋白能夠感受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中的折疊壓力，并促進(jìn)ATF4蛋白的表達(dá)[8]。X盒結(jié)合蛋白1（X box binding protein 1,XBP1）是一種轉(zhuǎn)錄因子，能夠被ATF6和IRE1激活，其中ATF6能夠促進(jìn)XBP1基因的表達(dá)，而IRE1則參與XBP1 mRNA的剪切，從而表達(dá)出具有活性的轉(zhuǎn)錄因子[9]。ATF4、ATF6和XBP1都是堿性亮氨酸拉鏈（basic leucine zipper,bZIP）轉(zhuǎn)錄因子，能夠直接與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激效應(yīng)元件（ER stress response element,ERSE）結(jié)合，激活UPR靶基因的轉(zhuǎn)錄[7,9]。

研究發(fā)現(xiàn)，激素和細(xì)胞因子的釋放、能量狀態(tài)的改變等都能夠改變內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)的通量，從而導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生[10]。仔豬早期斷奶是在豬生產(chǎn)過(guò)程中最常見的誘導(dǎo)應(yīng)激發(fā)生的事件之一。仔豬在早期斷奶過(guò)程中，食物狀態(tài)的快速轉(zhuǎn)變會(huì)引發(fā)仔豬嚴(yán)重的饑餓應(yīng)激。研究表明，早期斷奶能夠使仔豬腸道消化吸收及黏膜屏障功能受損，同時(shí)降低腸道消化酶的活性，引起腸道消化吸收功能的減弱和仔豬營(yíng)養(yǎng)缺乏[11-12]，而由營(yíng)養(yǎng)饑餓引發(fā)的蛋白質(zhì)代謝的改變可能直接影響到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的結(jié)構(gòu)與功能。

多項(xiàng)研究顯示，在斷奶仔豬日糧中補(bǔ)充特定的氨基酸能夠減緩由斷奶刺激引發(fā)的器官損傷[13-15]。其中，在日糧中添加精氨酸能夠促進(jìn)腸黏膜微血管的發(fā)育[16]，促進(jìn)β-防御素基因和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)[13,17]。而作為一種重要的支鏈氨基酸，亮氨酸能參與蛋白質(zhì)生物合成、胰島素信號(hào)傳導(dǎo)、骨骼肌的能量調(diào)節(jié)等過(guò)程。此外，在肝中亮氨酸對(duì)糖脂代謝具有重要的調(diào)節(jié)作用[18]，并且肝作為機(jī)體內(nèi)蛋白質(zhì)代謝最旺盛的器官，亮氨酸也能影響其蛋白質(zhì)的合成，從而影響肝中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能[19-20]。因此，本試驗(yàn)通過(guò)給斷奶仔豬飼喂不同含量的亮氨酸日糧以研究亮氨酸對(duì)早期斷奶引起的肝內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響，為仔豬的早期營(yíng)養(yǎng)調(diào)控提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

動(dòng)物試驗(yàn)選用的斷奶仔豬為華中農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家家畜工程技術(shù)中心精品豬場(chǎng)健康仔豬，品種為長(zhǎng)×大二元仔豬；所有動(dòng)物試驗(yàn)的操作均經(jīng)過(guò)華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

細(xì)胞試驗(yàn)中使用的人肝癌細(xì)胞系（human hepatocarcinoma cell,HepG2）由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院楊在清老師饋贈(zèng)；細(xì)胞試驗(yàn)所用基礎(chǔ)培養(yǎng)基（DMEM）、無(wú)葡萄糖培養(yǎng)基（glucose-free DMEM）、胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）、Earle平衡鹽緩沖液（Earle’s balanced salt solution,EBSS）和青霉素-鏈霉素（penicillin-streptomycin）均購(gòu)于美國(guó)Gibco公司；低葡萄糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基（low glucose DMEM）和氨基酸缺失培養(yǎng)基（amino acid-free RPMI-1640）購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；免疫印跡試驗(yàn)中的XBP1、ATF4、ATF6、HDAC1和β-actin抗體均購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司，所用二抗購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；核質(zhì)分離試驗(yàn)所用試劑盒購(gòu)于美國(guó)Thermo Fisher科技公司。

1.2 動(dòng)物試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)Ⅰ：選取18頭體質(zhì)量接近的閹割仔豬，隨機(jī)平均分為2組，每組9頭，分別為對(duì)照組和斷奶組。對(duì)照組仔豬為哺乳仔豬；斷奶組仔豬在14日齡進(jìn)行斷奶，并補(bǔ)充仔豬教槽料，同時(shí)試驗(yàn)期間保持自由采食和飲水。于仔豬15日齡和16日齡時(shí)，分別從2組中隨機(jī)各選取3頭進(jìn)行屠宰取樣。

試驗(yàn)Ⅱ：選取48頭體質(zhì)量接近的14日齡閹割仔豬，隨機(jī)平均分為2組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)8頭，分別為對(duì)照組和高亮氨酸組。仔豬由14日齡開始進(jìn)行誘飼，對(duì)照組仔豬飼喂基礎(chǔ)日糧，日糧亮氨酸含量為1.66%；高亮氨酸組在基礎(chǔ)日糧中額外添加0.44%的亮氨酸。日糧組成和營(yíng)養(yǎng)成分見表1。在21日齡時(shí)從2組中各選取3頭仔豬進(jìn)行屠宰取樣，剩余仔豬進(jìn)行斷奶處理；斷奶后，在22日齡時(shí)再?gòu)?組中各選取3頭仔豬進(jìn)行屠宰取樣。

2次試驗(yàn)均采集仔豬肝組織樣品，其中部分樣品剪成1 mm×1 mm×1 mm的小塊后于2.5%戊二醛中固定；其余樣品剪成小塊以錫箔紙包裹，于液氮中速凍后放入-80℃冰箱中保存。

1.3 細(xì)胞試驗(yàn)處理

1.3.1 營(yíng)養(yǎng)缺失處理試驗(yàn)

試驗(yàn)前，將HepG2細(xì)胞培養(yǎng)于正常完全培養(yǎng)基中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至密度為80%時(shí)，將完全培養(yǎng)基分別更換為以下培養(yǎng)基：正常新鮮完全培養(yǎng)基（CK）、含0.75μg/mL衣霉素（內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的誘導(dǎo)劑，作為陽(yáng)性對(duì)照）的完全培養(yǎng)基（tunicamycin,TUN）、完全饑餓培養(yǎng)基（EBSS）、低糖培養(yǎng)基（low glucose,LG）、無(wú)糖培養(yǎng)基（no glucose,-G）、無(wú)亮氨酸培養(yǎng)基（no leucine,-LEU）和無(wú)氨基酸培養(yǎng)基（no amino acid,-AA），處理1 h后收集細(xì)胞樣品。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平Table1 Composition and nutrient level of basal diets

1.3.2 亮氨酸缺失與再補(bǔ)加試驗(yàn)

亮氨酸缺失處理與營(yíng)養(yǎng)缺失處理相同，但亮氨酸缺失處理時(shí)間分別設(shè)置為0、0.5、1、2和4 h，處理完成后統(tǒng)一收集細(xì)胞樣品。

亮氨酸的再補(bǔ)加試驗(yàn)是在亮氨酸缺失1 h后，向培養(yǎng)基中補(bǔ)加亮氨酸，使培養(yǎng)基中亮氨酸的終濃度分別為1和10 mmol/L。CK為對(duì)照組，在TUN組中加入0.75μg/mL衣霉素。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 仔豬肝組織的電鏡檢測(cè)

采集肝樣品時(shí)，保持采集位置的一致性，將所采集的樣品用2.5%戊二醛固定2 h后，使用1%鋨酸固定液再固定2～3 h；之后通過(guò)梯度脫水程序，在37℃條件下，使用Epon包埋2～3 h，并制作超薄切片；最后用3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色后在透射電鏡下進(jìn)行觀察。

1.4.2 肝組織和細(xì)胞樣品的核質(zhì)分離

肝組織和HepG2細(xì)胞的核質(zhì)分離試驗(yàn)均使用美國(guó)Thermo Fisher科技公司的核質(zhì)分離試劑盒完成，相關(guān)分離操作依照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。取肝組織研磨成粉末和細(xì)胞沉淀，使用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液洗滌3次，每次洗滌后均于4℃、1 000 r/min下離心5 min。將收集到的沉淀重懸于預(yù)冷的細(xì)胞質(zhì)提取試劑CERⅠ溶液（使用前加入1μg/mL亮抑酶肽，1μg/mL胃蛋白酶抑制劑，1μg/mL抑肽酶和50μg/mL苯甲基磺酰氟）中，并按比例加入CERⅡ溶液。經(jīng)過(guò)4℃、1.6萬(wàn)r/min離心5 min后，收集到的上清液即為細(xì)胞質(zhì)蛋白組分。隨后，沉淀用細(xì)胞核提取試劑NER溶液（使用前加入蛋白酶抑制劑）重懸，冰上裂解10 min后渦旋5 s。將裂解和渦旋操作重復(fù)4次后，經(jīng)過(guò)4℃、1.6萬(wàn)r/min離心10 min，所得上清液即為細(xì)胞核蛋白組分。

1.4.3 蛋白質(zhì)樣品的免疫印跡檢測(cè)分析

將肝組織和HepG2細(xì)胞中提取的蛋白質(zhì)樣品用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodiumdodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDSPAGE）進(jìn)行分離。然后將蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（polyvinylidenedifluoride,PVDF）膜上，并將電轉(zhuǎn)后的PVDF膜置于5%脫脂奶粉[溶于含0.1%Tween 20的三乙醇胺緩沖鹽溶液（tris-buffered saline with Tween 20,TBST）]中室溫封閉1 h。之后，將PVDF膜置入用TBST稀釋適當(dāng)濃度的一抗中4℃過(guò)夜孵育。第2天，經(jīng)TBST洗滌后，將PVDF膜置入用TBST稀釋適當(dāng)濃度的二抗中室溫孵育1 h。顯影后的結(jié)果使用Image J軟件進(jìn)行定量分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均進(jìn)行至少3次獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)。采用Graphpad prism 5軟件的學(xué)生t檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，并采用雙尾t檢驗(yàn)進(jìn)行分析。試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 仔豬的早期斷奶應(yīng)激誘發(fā)肝內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的形態(tài)結(jié)構(gòu)與其功能高度相關(guān)。電鏡圖像（圖1A）顯示：在正常條件下，仔豬肝組織細(xì)胞內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)口徑狹窄，平滑折疊的環(huán)繞于線粒體；而在斷奶后24 h，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)口徑出現(xiàn)顯著擴(kuò)張，且內(nèi)質(zhì)網(wǎng)明顯增多；隨著斷奶時(shí)間的延長(zhǎng)，在斷奶后48 h，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)大量增生并且折疊結(jié)構(gòu)混亂。為進(jìn)一步分析早期斷奶是否影響肝內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，我們對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)志性蛋白XBP1[21]在細(xì)胞核中的含量進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果（圖1B）顯示：斷奶后24 h，仔豬肝組織中細(xì)胞核內(nèi)XBP1蛋白含量顯著上調(diào)；而斷奶后48 h，細(xì)胞核內(nèi)XBP1的表達(dá)水平未見顯著變化。這些結(jié)果表明，早期斷奶能夠誘導(dǎo)仔豬肝內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生，但這種誘導(dǎo)作用存在一定的時(shí)限。

2.2 不同營(yíng)養(yǎng)缺失處理對(duì)Hep G2細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響

由于仔豬的消化系統(tǒng)發(fā)育不完全，營(yíng)養(yǎng)饑餓往往是早期斷奶過(guò)程的主要刺激因素之一[22-23]。同時(shí)，營(yíng)養(yǎng)不足也被認(rèn)為是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生的一個(gè)誘導(dǎo)因素，其中葡萄糖缺失已被證實(shí)能夠誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生，并且多個(gè)葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白（glucose regulated protein,GRP）是參與UPR反應(yīng)的關(guān)鍵蛋白，如GRP78[24]。體外肝細(xì)胞（HepG2）試驗(yàn)的結(jié)果（圖2）表明：低葡萄糖和葡萄糖缺失處理均能顯著上調(diào)細(xì)胞核內(nèi)的ATF4和ATF6α的表達(dá)（P＜0.05）；同時(shí)，EBSS處理和亮氨酸的缺失也能夠誘導(dǎo)細(xì)胞核內(nèi)的ATF6α顯著上調(diào)表達(dá)（P＜0.05）；此外，1 h氨基酸饑餓處理未能顯著改變內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，這一結(jié)果與亮氨酸的缺失對(duì)ATF6α的上調(diào)表達(dá)相反，暗示單一亮氨酸的缺失對(duì)HepG2中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生更具有誘導(dǎo)效應(yīng)。然而，在所有處理?xiàng)l件下的XBP1均呈現(xiàn)差異表達(dá)，這提示我們XBP1表達(dá)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生過(guò)程中具有滯后性。上述結(jié)果表明，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺失能夠誘導(dǎo)肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生，而亮氨酸的缺失能夠誘導(dǎo)HepG2中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生。

圖1 早期斷奶對(duì)仔豬肝組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)及XBP1蛋白表達(dá)的影響Fig.1 Effects of early weaning on morphology of endoplasmic reticulum(ER)and expression of XBP1 protein in the liver of piglets

圖2 在不同營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺失處理下Hep G2細(xì)胞內(nèi)ATF6α、ATF4和XBP1在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)的豐度變化Fig.2 Abundance changes of ATF6α,ATF4 and XBP1 in the cytoplasm and nucleus of HepG2 cells under different nutrient deficiency levels

2.3 亮氨酸對(duì)Hep G2細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的調(diào)節(jié)

為了探究亮氨酸對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響，將HepG2細(xì)胞培養(yǎng)于亮氨酸缺失的培養(yǎng)基中，結(jié)果如圖3所示。與對(duì)照組相比，亮氨酸缺失0.5、1和2 h均能夠顯著上調(diào)細(xì)胞質(zhì)中ATF6α的表達(dá)（P＜0.05），而細(xì)胞核內(nèi)的ATF4和ATF6α在亮氨酸缺失1 h處理?xiàng)l件下均呈現(xiàn)顯著上調(diào)表達(dá)（P＜0.05）。同時(shí)，亮氨酸的再補(bǔ)加試驗(yàn)顯示，添加1和10 mmol/L亮氨酸均能顯著上調(diào)細(xì)胞核內(nèi)ATF4的表達(dá)（P＜0.05）。上述結(jié)果表明，亮氨酸缺失能夠誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，而1和10 mmol/L亮氨酸的加入加重了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應(yīng)激狀態(tài)。

2.4 不同亮氨酸水平對(duì)早期斷奶應(yīng)激誘發(fā)的仔豬肝內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響

如圖4所示：在未斷奶條件下，飼用高水平亮氨酸日糧并不影響仔豬肝中ATF4和ATF6α的表達(dá)；斷奶處理24 h后，仔豬肝組織細(xì)胞核內(nèi)ATF4和ATF6α均呈顯著性上調(diào)表達(dá)（P＜0.05）。這一結(jié)果表明亮氨酸能夠增強(qiáng)早期斷奶誘發(fā)的仔豬肝內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。

圖3 亮氨酸缺失及再補(bǔ)加對(duì)Hep G2細(xì)胞中ATF6α和ATF4蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effectsof leucinedeprivation and restimulation on expression of ATF6αand ATF4 proteinsin HepG2 cells

圖4 不同亮氨酸水平對(duì)斷奶仔豬肝內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effects of different leucine（Leu）levels on expression of ERstress-associated proteins in the liver of weaning piglets

3 討論

仔豬的早期斷奶應(yīng)激是仔豬經(jīng)受的最嚴(yán)重的應(yīng)激事件之一，在早期斷奶過(guò)程中仔豬的采食量及生長(zhǎng)速率都呈現(xiàn)顯著下調(diào)[22]。為了應(yīng)對(duì)斷奶過(guò)程中產(chǎn)生的各種刺激，仔豬往往通過(guò)調(diào)整其自身體內(nèi)的能量供給狀態(tài)以度過(guò)這一應(yīng)激過(guò)程，這種調(diào)整通常包括增加血液供給、加強(qiáng)能量生成、改變免疫以及炎癥反應(yīng)等[25]。這樣的過(guò)程也伴隨著蛋白質(zhì)合成速率的改變，進(jìn)而影響了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能。當(dāng)來(lái)自細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外的刺激誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生時(shí)，細(xì)胞通過(guò)UPR反應(yīng)減弱刺激從而維持細(xì)胞代謝的穩(wěn)態(tài)[26]。本研究顯示，仔豬在斷奶24 h后，其肝組織內(nèi)肝細(xì)胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)口徑顯著增加且形態(tài)出現(xiàn)紊亂，并且核內(nèi)的XBP1表達(dá)呈現(xiàn)顯著上調(diào)，表明早期斷奶能夠誘導(dǎo)肝組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生。

仔豬在早期斷奶過(guò)程的所有刺激中，營(yíng)養(yǎng)水平是其中非常重要的一個(gè)因素。研究顯示，早期斷奶能夠損害仔豬的腸道黏膜功能，影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收[23]。而營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的缺失也同樣是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生的誘導(dǎo)因素之一[26]。在體外肝細(xì)胞中的模擬試驗(yàn)表明，葡萄糖以及亮氨酸的缺失能夠顯著上調(diào)細(xì)胞核內(nèi)ATF4和剪切后ATF6α的表達(dá)。這一結(jié)果顯示，葡萄糖、氨基酸（尤其是亮氨酸）等營(yíng)養(yǎng)的饑餓處理能夠誘導(dǎo)肝細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生。

有報(bào)道指出，葡萄糖的缺失能夠通過(guò)氨基己糖通路誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生，從而激活UPR通路及CHOP介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路[27]。在小鼠肝中，亮氨酸能夠抑制過(guò)度發(fā)生的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及自噬[28]。此外，精氨酸的缺失能夠促進(jìn)ATF4的翻譯，增強(qiáng)UPR反應(yīng)[29]。在本研究中，亮氨酸缺失能夠顯著上調(diào)肝細(xì)胞核內(nèi)ATF4和ATF6α剪切體蛋白的表達(dá)，表明亮氨酸可以獨(dú)立誘導(dǎo)肝細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生。然而，當(dāng)在亮氨酸缺失培養(yǎng)基中補(bǔ)加1 mmol/L或者10 mmol/L亮氨酸時(shí)，細(xì)胞核內(nèi)ATF4的表達(dá)也呈現(xiàn)顯著性上調(diào)。此外，不同亮氨酸含量的日糧對(duì)于正常21日齡仔豬肝內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激無(wú)顯著影響；但是在仔豬斷奶24 h后，用高水平亮氨酸日糧飼喂的仔豬肝組織中肝細(xì)胞核內(nèi)定位的ATF4出現(xiàn)顯著上調(diào)。這與HepG2細(xì)胞試驗(yàn)中亮氨酸過(guò)量再補(bǔ)加的結(jié)果相似，推測(cè)這一現(xiàn)象可能與氨基酸的代謝功能相關(guān)。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶PERK的激活能夠增加eIF2α的磷酸化水平從而抑制蛋白質(zhì)的合成[30-32]。然而，氨基酸作為一種營(yíng)養(yǎng)信號(hào)，能夠直接刺激蛋白質(zhì)的合成，亮氨酸的作用尤其明顯[33]。作為一種支鏈氨基酸，亮氨酸能夠通過(guò)與其感受體結(jié)合，強(qiáng)烈地刺激體內(nèi)雷帕霉素靶蛋白復(fù)合體1（mechanistictargetof rapamycincomplex1,mTORC1）信號(hào)通路的激活，進(jìn)而促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成[34-35]。同時(shí)，早期斷奶能夠誘導(dǎo)仔豬肝、脾和骨骼肌中自噬的發(fā)生[36]。自噬對(duì)幼年動(dòng)物具有重要的維持生存作用，而亮氨酸是細(xì)胞自噬的抑制劑。研究證明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生后能夠依賴于IRE1-JNK通路激活自噬，并利用其降解再循環(huán)的功能維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)[37]。而KOUROKU等[38]發(fā)現(xiàn)，異常表達(dá)的多聚谷氨酰胺72能誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生，并伴隨著細(xì)胞中PERK/eIF2α磷酸化介導(dǎo)的LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)變。有觀點(diǎn)認(rèn)為，細(xì)胞自噬對(duì)蛋白質(zhì)的降解作用有助于減緩內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)處理壓力，幫助內(nèi)質(zhì)網(wǎng)恢復(fù)穩(wěn)態(tài)。因此，亮氨酸的促蛋白質(zhì)合成功能及其對(duì)自噬的抑制作用可能加劇了細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和UPR反應(yīng)，使得核內(nèi)的ATF4呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)。此外，在動(dòng)物生長(zhǎng)的早期階段，氨基酸能夠參與調(diào)節(jié)多個(gè)重要的代謝過(guò)程，包括生長(zhǎng)、穩(wěn)態(tài)、免疫、食物的攝取與利用及蛋白質(zhì)的合成等[39-41]。而研究顯示，在日糧中添加1%、2%和4%亮氨酸并不能顯著提高早期斷奶仔豬的日增質(zhì)量和采食量，在日糧中6%的亮氨酸添加量甚至?xí)@著抑制仔豬的生長(zhǎng)[42]。這一現(xiàn)象出現(xiàn)的原因可能是日糧中高水平的亮氨酸損害了機(jī)體的氨基酸的平衡[41]。然而B’CHIR等[43]報(bào)道指出，隨著亮氨酸水平的不斷上升，全細(xì)胞水平的ATF4表達(dá)量不斷下調(diào)。因此，亮氨酸對(duì)于仔豬肝內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激具有重要的調(diào)節(jié)功能，但其調(diào)節(jié)機(jī)制仍有待闡明。

4 結(jié)論

本研究表明，早期斷奶能夠誘導(dǎo)仔豬肝中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生，而亮氨酸對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激具有重要的調(diào)控功能，無(wú)論是亮氨酸的缺失還是過(guò)量都會(huì)引起肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生。因此，篩選出適宜的亮氨酸濃度對(duì)于減緩仔豬斷奶后的應(yīng)激狀態(tài)具有十分重要的意義。

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