不同劑量FTY720對顱腦損傷大鼠神經(jīng)功能的保護(hù)作用

林群 蔡建勇 吳艷 巴華君 陸川 陳獻(xiàn)東 陳茂華 戴君俠 孫軍

藥物是治療創(chuàng)傷性腦損傷的重要手段[1]，而抑制神經(jīng)系統(tǒng)免疫反應(yīng)是創(chuàng)傷性腦損傷藥物治療的重要機(jī)制[2]。FTY720是一種由冬蟲夏草抽提物中具有免疫作用的物質(zhì)改造而成的新型免疫抑制劑[3]。它對免疫抑制具有雙向調(diào)節(jié)作用，在體內(nèi)抑制免疫反應(yīng)發(fā)生的同時不削弱機(jī)體對病毒的免疫應(yīng)答及免疫記憶能力，進(jìn)而不增加機(jī)體感染的發(fā)生率[4]。臨床試驗已經(jīng)證實，F(xiàn)TY720可明顯改善多發(fā)性硬化癥的病情，且顯著抑制腎移植排斥反應(yīng)[5]。筆者既往研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TY720可有效抑制顱腦損傷大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡和腦炎癥反應(yīng)，進(jìn)而改善腦損傷大鼠運動功能和認(rèn)知功能[6-8]。然而，對FTY720的劑量療效關(guān)系尚未作進(jìn)一步研究。故本研究采用不同劑量FTY720治療大鼠顱腦損傷，觀察其對大鼠腦炎癥反應(yīng)、神經(jīng)細(xì)胞凋亡和神經(jīng)功能的影響，從而揭示其劑量療效關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 實驗動物分組及造模方法 80只健康雄性Wistar大鼠［南京大學(xué)模式動物研究所，雄性，清潔級，體重250～300g，實驗動物生產(chǎn)許可證 SCXK（蘇）2005-0003，使用許可證SYXK（蘇）2005-0004］。隨機(jī)分成假手術(shù)組、模型組、小劑量組和大劑量組，每組20只。大鼠予50mg/kg戊巴比妥鈉腹腔麻醉后，采用Feeney自由落體損傷裝置制作大鼠顱腦損傷模型。假手術(shù)組大鼠切開頭皮，顱骨鉆孔后縫合頭皮，不作外力打擊。假手術(shù)組和模型組大鼠手術(shù)操作完成前0.5h腹腔注射1ml 0.9%氯化鈉注射液，小劑量組和大劑量組大鼠手術(shù)操作完成前0.5h分別按1、5mg/kg劑量腹腔注射FTY720（規(guī)格：25mg，批號：SML0700，美國Sigma公司）。在手術(shù)操作完成后24h，取每組大鼠10只，以80mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射深度麻醉，斷頭處死，分離損傷皮層周邊腦組織。每組剩余10只大鼠留作神經(jīng)功能評價。大鼠受外力打擊后有一過性的呼吸抑制，0.5h內(nèi)基本恢復(fù)正常。各組大鼠手術(shù)操作后有少量死亡，大鼠死亡后補(bǔ)充成活大鼠，保證每組20只大鼠。

1.2 指標(biāo)檢測 采用TUNEL法（TUNEL試劑盒購于中國武漢博士德生物工程有限公司，批號：MK1024）檢測大鼠損傷皮層凋亡神經(jīng)細(xì)胞，細(xì)胞核染色呈棕黃色或棕紅色定義為細(xì)胞染色陽性，在Olympus-CH光學(xué)顯微鏡下計算10個高倍鏡視野，每個視野計數(shù)100個細(xì)胞，總計1 000個細(xì)胞，計算平均陽性率（%），即凋亡神經(jīng)細(xì)胞比例。采用四肽熒光底物法檢測大鼠損傷皮層Caspase-3蛋白活性（Caspase-3蛋白活性檢測試劑盒購于美國Livemore公司，批號：T9281），以未加腦組織時的熒光強(qiáng)度為參照值，計算熒光強(qiáng)度，最終比較相對熒光強(qiáng)度。采用ELISA法測定大鼠腦組織TNF-α（試劑盒購于美國R&D公司，批號：MTA00B）、IL-1β（試劑盒購于美國R&D公司，批號：M6000B）和IL-6（試劑盒購于美國R&D公司，批號：MLB00C）水平，結(jié)果表示為pg/mg腦組織。

1.3 大鼠神經(jīng)功能評價 參照Vorhees等[9]的方法，采用Morris水迷宮定位航行實驗在腦損傷后第8、9、10、11、12天記錄大鼠逃避潛伏期，逃避潛伏期越長表示大鼠認(rèn)知功能越差。參考Chen等[10]的方法，在腦損傷后第 14、15、16、17、18 天測定大鼠改良神經(jīng)功能缺損程度評分，評分范圍為0～18分，分值越高表示神經(jīng)功能損傷越嚴(yán)重。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件。計量資料用表示，采用單變量方差分析比較4組大鼠逃避潛伏期、改良神經(jīng)功能缺損程度評分，TNF-α、IL-1β和IL-6水平，神經(jīng)細(xì)胞凋亡比例、Caspase-3蛋白活性；采用重復(fù)測量方差分析比較各組大鼠不同時點逃避潛伏期、改良神經(jīng)功能缺損程度評分；組間兩兩比較采用LSD-t法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FTY720對顱腦損傷大鼠逃避潛伏期的影響 在顱腦損傷后第 8、9、10、11、12 天，4 組大鼠逃避潛伏期比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）；組間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。各組大鼠不同時點逃避潛伏期比較，差異亦均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）；且隨著藥物劑量升高，大鼠逃避潛伏期明顯縮短，藥效呈劑量依賴性（P＜0.01），見表1。

表1 FTY720對顱腦損傷大鼠逃避潛伏期的影響

2.2 FTY720對顱腦損傷大鼠改良神經(jīng)功能缺損程度評分的影響 假手術(shù)組大鼠改良神經(jīng)功能缺損程度評分均為最低分，即為0分。在顱腦損傷后第14、15、16、17、18天，3組大鼠改良神經(jīng)功能缺損程度評分比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）；組間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。各組大鼠不同時點改良神經(jīng)功能缺損程度評分比較，差異亦均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）；且隨著藥物劑量升高，大鼠改良神經(jīng)功能缺損程度評分明顯下降，藥效呈劑量依賴性（P＜0.01），見表 2。

表2 FTY720對顱腦損傷大鼠改良神經(jīng)功能缺損程度評分的影響

2.3 FTY720對顱腦損傷大鼠損傷皮層炎性因子水平及凋亡相關(guān)指標(biāo)的影響 假手術(shù)組、模型組、小劑量組和大劑量組大鼠損傷皮層IL-1β、TNF-α和IL-6水平以及Caspase-3蛋白活性、凋亡神經(jīng)細(xì)胞比例比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）；組間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01），隨著藥物劑量升高，上述指標(biāo)均明顯下降，藥效呈劑量依賴性，見表3和圖1。

表3 FTY720對顱腦損傷大鼠損傷皮層炎性因子水平及凋亡相關(guān)指標(biāo)的影響

圖1 FTY720對顱腦損傷大鼠損傷皮層神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響（TUNEL法，×100）

3 討論

創(chuàng)傷性腦損傷是一種嚴(yán)重的外傷形式，死亡率和致殘率均較高，預(yù)后往往不理想。外力觸發(fā)的繼發(fā)性腦損傷呈現(xiàn)瀑布式反應(yīng)，涉及炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡。腦外傷后，腦膠質(zhì)細(xì)胞被激活，從而釋放包括TNF-α、IL-1β和IL-6在內(nèi)的大量炎癥介質(zhì)，進(jìn)而激活凋亡蛋白Caspase-3。激活的Caspase-3能使許多與細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞周期及DNA修復(fù)等相關(guān)蛋白或激酶失活，從而使細(xì)胞凋亡[11-14]。因此，抑制炎癥反應(yīng)、降低神經(jīng)細(xì)胞凋亡可降低創(chuàng)傷性腦損傷，從而改善顱腦損傷的預(yù)后。

FTY720是最近幾年新開發(fā)的一種免疫抑制劑，屬于鞘氨醇-1-磷酸鹽受體阻滯劑[3]。FTY720誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞凋亡，加速外周循環(huán)的成熟淋巴細(xì)胞歸巢和抑制T細(xì)胞從胸腺向外周血循環(huán)的轉(zhuǎn)移，從而選擇性減少外周循環(huán)淋巴細(xì)胞數(shù)，但并不損害對病毒的免疫應(yīng)答及免疫記憶功能，毒副反應(yīng)小[4]。目前，F(xiàn)TY720在臨床上的應(yīng)用得到了推廣，已用于肝腎器官移植后的排斥反應(yīng)及皮炎、重癥肌無力等免疫紊亂/障礙疾病的治療[5]。由于FTY720具有免疫抑制和調(diào)節(jié)作用，F(xiàn)TY720在其他炎癥性疾病中的作用也得到了重視。FTY20治療出血性、外傷性及缺血性腦損傷動物具有顯著效果，可抑制腦炎癥反應(yīng)，減低神經(jīng)細(xì)胞凋亡，改善神經(jīng)功能[15-18]。筆者既往研究也證實了該藥對治療顱腦損傷大鼠具有顯著效果，可抑制神經(jīng)炎癥反應(yīng)，降低神經(jīng)細(xì)胞凋亡，改善大鼠運動功能和認(rèn)知功能[6-8]?？上У氖牵壳吧儆醒芯拷沂綟TY720用于治療實驗性腦損傷的劑量療效關(guān)系。既往研究常規(guī)選擇1mg/kg劑量治療動物腦損傷[6-8,15-18]，本研究設(shè)置1、5 mg/kg兩個劑量 FTY720腹腔注射治療大鼠創(chuàng)傷性腦損傷。研究結(jié)果顯示，兩個劑量的FTY20腹腔注射均顯著抑制大鼠損傷皮層神經(jīng)細(xì)胞凋亡和Caspase-3活性，降低腦組織TNF-α、IL-1β和IL-6水平，改善大鼠運動功能和認(rèn)知功能。FTY720對抑制體外培養(yǎng)的膠質(zhì)細(xì)胞分泌炎性因子具有顯著作用[19]，也可阻止大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后炎性細(xì)胞在皮層的聚集[18]，同時抑制大鼠腦出血后腦內(nèi)淋巴細(xì)胞浸潤[15]，從而表現(xiàn)出有效的中樞神經(jīng)系統(tǒng)抗炎作用。FTY720在抑制大鼠短暫性腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞死亡和腦出血后腦水腫方面具有顯著效果，最終明顯改善了大鼠腦功能[16-17]。

以上數(shù)據(jù)結(jié)合本研究結(jié)果，筆者推測FTY720改善大鼠顱腦損傷后神經(jīng)功能效果顯著，且存有療效-劑量依賴關(guān)系，而它的作用機(jī)制可能與FYT720抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)從而降低神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān)。

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