乳腺癌干細(xì)胞的樹突狀細(xì)胞疫苗對細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞增殖的影響

彭瑩瑩 葉小磊

近年來研究發(fā)現(xiàn)，癌細(xì)胞中有一部分被認(rèn)為具有干細(xì)胞特性，可起始腫瘤形成并維持腫瘤的持續(xù)生長，這類細(xì)胞被稱為腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞，它們在腫瘤的形成與發(fā)展過程中起著重要作用[1-3]。人類乳腺癌干細(xì)胞（BSC）具有干/祖細(xì)胞特性，即增殖性、自我更新和一定的分化能力等[3]，但多數(shù)情況下BSC不表達(dá)腫瘤抗原，可逃避免疫監(jiān)視[4-5]，這與乳腺癌的復(fù)發(fā)及耐藥相關(guān)。目前尚無有效的治療手段對BSC進(jìn)行干預(yù)[6-8]。臨床試驗顯示，樹突狀細(xì)胞（DC）疫苗對雌激素受體（ER）/孕激素受體（PR）雙陰性或三陰性Ⅱ/Ⅲa期乳腺癌患者具有治療效果，但這種免疫治療方法局限于部分乳腺癌患者。目前，已有研究證實異質(zhì)腫瘤可用作抗原以產(chǎn)生效應(yīng)T細(xì)胞或誘導(dǎo)DC疫苗[9-10]，但耐藥率較高。因此，從增強患者自身免疫力的角度，探索一種新的免疫治療手段是目前腫瘤綜合治療的研究熱點。本研究首先從乳腺癌患者中分離獲得BSC，并進(jìn)行三維培養(yǎng)及表型鑒定，觀察BSC的DC疫苗對細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）增殖的影響，以探討B(tài)SC作為抗乳腺癌DC疫苗加載抗原的潛力。

1 材料和方法

1.1 主要材料及儀器 膠原酶/透明質(zhì)酸酶1∶1溶液（400IU/mg，美國Sigma公司）；表皮細(xì)胞生長因子（EGF）（0.1ng/ml，美國 Peprotech公司）；胰島素（23.7IU/mg，美國 Sigma 公司）；B27（10ml，美國 Gibco 公司）；DMEMF12（50L，美國 Gibco公司）；抗 CD44-PE、抗 CD24-FITC、CD133-PE（125μl，美國 BioLegend 公司）；Ficoll/Paque（100ml，美國 Invitrogen 公司）；Bio-Rad 蛋白測定試劑（440次標(biāo)準(zhǔn)測試，美國Bio-Rad公司）；免疫球蛋白測定（ELISPOT）試劑盒（50次，美國R&D Systems公司）；乳酸脫氫酶釋放測定試劑盒（CytoTox 96非放射性細(xì)胞毒性測定，美國Promega公司）。超聲波細(xì)胞分離裝置（Biosafer150-96，賽飛中國生物科技有限公司）；流式細(xì)胞儀（Attune Nxt，美國Life technology公司）。

1.2 BSC的分離培養(yǎng) 經(jīng)醫(yī)院倫理委員會討論通過且所有患者簽署知情同意書，采集2017年3月10日至6月10日收住寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院甲乳外科的11例乳腺癌患者手術(shù)切除的腫瘤組織，臨床診斷經(jīng)組織學(xué)和病理學(xué)確認(rèn)。組織離體2h內(nèi)作以下處理（按照乳腺癌細(xì)胞球的培養(yǎng)方法進(jìn)行[11-12]）：用眼科剪將組織進(jìn)行機械分解，放入膠原酶/透明質(zhì)酸酶1∶1溶液中，37℃孵育4h；經(jīng)40μm濾器過濾，將單細(xì)胞以1 000個/ml鋪板（通過Poly-Hema 4℃預(yù)包被），培養(yǎng)基中含有 bFGF 10ng/ml、EGF 20ng/ml、胰島素 5μg/ml、B27添加劑的無血清DMEM-F12。此條件下生長的細(xì)胞被稱為懸浮生長的球形細(xì)胞簇，每隔3～5d，胰酶37℃消化15min。

1.3 BSC的鑒定 使用流式細(xì)胞儀鑒定BSC標(biāo)志物在細(xì)胞球或血清條件下培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞中的表達(dá)。使用的抗體是CD44-PE、CD24-FITC和CD133-PE。使用小鼠IgG1抗體作為Bio-Legend抗體的同種型對照。細(xì)胞加入胰酶37℃消化5min后，吹打重懸成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個/ml，將抗體加入到細(xì)胞懸液中，避光孵育30min，進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測[13]。

1.4 負(fù)載BSC抗原的DC刺激CTL后的殺傷效果以及IFN-γ檢測 通過Ficoll/Paque從健康供體的外周血單核細(xì)胞（PBMCs）制備人未成熟 DC。將 PBMCs（9×106個細(xì)胞/3ml/孔）接種到含有RPMI1640的6孔板中，37℃孵育1.5h，取貼壁細(xì)胞用于DC的傳代培養(yǎng)。使用超聲波細(xì)胞分離裝置將培養(yǎng)好的BSC制備為細(xì)胞懸液，取3～6百萬個細(xì)胞（包括BSC）的蛋白裂解液作為刺激抗原。使用Bio-Rad蛋白測定試劑檢測腫瘤抗原蛋白濃度。用含有BSC裂解物的自體DC（BSC裂解劑和DC在用淋巴細(xì)胞接種之前共同培養(yǎng)過夜）以5∶1的比例刺激非黏附淋巴細(xì)胞。將300IU/ml IL-2加入培養(yǎng)基中，每隔3d加1次。淋巴細(xì)胞每5d用DC刺激3次以上，最終將產(chǎn)生超過90%的CD3+T細(xì)胞（數(shù)據(jù)未顯示）。根據(jù)說明書，使用乳酸脫氫酶釋放測定試劑盒測試CTL介導(dǎo)的BSC細(xì)胞毒性。靶細(xì)胞是乳腺癌的細(xì)胞球和貼壁細(xì)胞。以未接受DC刺激的CTL為空白對照組。效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞的比例為 2.5∶1、5∶1、10∶1、20∶1和40∶1。細(xì)胞毒性抑制率計算公式：細(xì)胞毒性（%）=將 激 發(fā) 的CTL 按 2.5∶1、5∶1、10∶1、20∶1 和 40∶1 的比例調(diào)整為 1×104個/ml孵育24h，并通過ELISPOT試劑盒測定IFN-γ的釋放水平。使用CTL分析儀對激發(fā)細(xì)胞中BSC特異性CTL的斑點計數(shù)和覆蓋面積進(jìn)行分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌細(xì)胞球的生長及BSC的特征 在DMEM/F12培養(yǎng)基中，一些細(xì)胞培養(yǎng)48h后逐漸形成小型細(xì)胞球，且不斷生長形成較大的細(xì)胞球，見圖1；其他細(xì)胞凋亡或保持未分化。通過流式細(xì)胞儀測定CD44和CD24標(biāo)志物的表達(dá)：例1、例5患者乳腺癌細(xì)胞球中CD44+、CD24-的細(xì)胞比例分別為97.76%和99.60%，見圖2；例4、例7患者貼壁單層和乳腺癌細(xì)胞球中CD44+、CD24-的細(xì)胞比例分別為0.06%和91.83%，但CD44+、CD24+雙陽性細(xì)胞的的比例在貼壁細(xì)胞（60.57%）而非乳腺癌細(xì)胞球（0.75%）中強烈表達(dá)，見圖3。例4患者貼壁細(xì)胞、例5患者乳腺癌細(xì)胞球中CD133+細(xì)胞比例分別為44.56%和97.20%，可見CD133在乳腺癌細(xì)胞球中高表達(dá)，見圖4。

圖1 乳腺癌細(xì)胞球顯微鏡下形態(tài)（a：例1患者，b：例5患者）

圖2 流式細(xì)胞儀檢測乳腺癌細(xì)胞球中CD44、CD24的表達(dá)（a-c：例1患者乳腺癌細(xì)胞球表達(dá)CD44，但不表達(dá)CD24；d-f：例5患者乳腺癌細(xì)胞球表達(dá)CD44，但不表達(dá)CD24）

圖3 流式細(xì)胞儀檢測貼壁單層及乳腺癌細(xì)胞球中CD44、CD24的表達(dá)（a-c：例4患者貼壁單層表達(dá)CD44和CD24；d-f：例7患者乳腺癌細(xì)胞球表達(dá)CD44，但不表達(dá)CD24）

圖4 流式細(xì)胞儀檢測貼壁細(xì)胞及乳腺癌細(xì)胞球中CD133的表達(dá)（a-c：例4患者貼壁細(xì)胞低表達(dá)CD133；d-f：例5患者乳腺癌細(xì)胞球高表達(dá)CD133）

2.2 CTL介導(dǎo)的BSC細(xì)胞毒性 使用從源自細(xì)胞球或貼壁細(xì)胞的裂解物致敏的DC在體外刺激CTL，以確定使用富含乳腺癌細(xì)胞球的腫瘤干細(xì)胞（CSC）進(jìn)行DC疫苗接種的效果。細(xì)胞球源自CD44+、CD24-的細(xì)胞比例為99.60%的例5患者（BSC-5），并保持類似培養(yǎng)條件用于培養(yǎng)衍生自BSC-5的乳腺癌細(xì)胞球細(xì)胞。成熟的DC能高度表達(dá)共刺激分子 CD80、CD86、CD83和 CD40[16-18]。使用CTL細(xì)胞毒性測定法測試刺激的細(xì)胞對BSC和BAC的細(xì)胞毒性。來自乳腺癌細(xì)胞球（BSC-CTL組）、貼壁細(xì)胞（BAC-CTL組）和空白對照（Blank-CTL組）的裂解物致敏的DC刺激CTL活性。針對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞溶解活性隨著效應(yīng)物∶靶細(xì)胞（E∶T）的比例增加而增加。BSC-CTL組乳腺細(xì)胞球的細(xì)胞毒性明顯高于Blank-CTL（P＜0.05），見圖 5a；而 BSC-CTL 組乳腺細(xì)胞球與貼壁細(xì)胞間的細(xì)胞毒性差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。BSC-CTL組乳腺細(xì)胞球的細(xì)胞毒性明顯高于BACCTL組（P＜0.05），見圖5b。BAC-CTL組乳腺細(xì)胞球的細(xì)胞毒性與Blank-CTL組相似。BAC-CTL組對貼壁細(xì)胞的細(xì)胞毒性高于乳腺細(xì)胞球（P＜0.05），見圖5c。BAC-CTL組、BSC-CTL組對貼壁細(xì)胞的細(xì)胞毒性高于Blank-CTL 組（P＜0.05），見圖 5d。

2.3 DC疫苗接種效果 使用來自乳腺癌細(xì)胞球和貼壁細(xì)胞的裂解物作為抗原，每一種抗原刺激PBMCs均誘導(dǎo)明顯的T細(xì)胞應(yīng)答，BSC-CTL組、BAC-CTL組、Blank-CTL組乳腺癌細(xì)胞球細(xì)胞通過IFN-γ ELISPOT分析產(chǎn)生點，見圖6。使用E∶T=40∶1的比例，BSC-CTL組、BAC-CTL組對大面積球細(xì)胞分別產(chǎn)生47、25個斑點。對斑點計數(shù)、覆蓋面積的觀察，可見BSC-CTL組的IFN-γ產(chǎn)生明顯高于BAC-CTL組（均P＜0.05）；BSCCTL組、BAC-CTL組的IFN-γ產(chǎn)生均高于Blank-CTL組（均P＜0.05）。同時，提高E∶T比例，會增加ELISPOT測定IFN-γ的斑點計數(shù)和覆蓋面積，見圖7。

3 討論

最近研究表明，小部分BSC亞群有助于乳腺癌的治療，預(yù)防耐藥性。目前關(guān)于BSC譜系的鑒定及分類尚不清楚。本研究分離并評估了來自臨床乳腺癌患者的BSC，并獲得了細(xì)胞球，與體內(nèi)貼壁細(xì)胞相比具有更強的致瘤能力。為有效改善耐藥性，需要研究新的治療策略，如免疫治療或靶向BSC的藥物等。相關(guān)研究證實，用雙硫侖封裝的脂質(zhì)體阻斷轉(zhuǎn)錄因子NF-κB活化，并在體外和體內(nèi)特異性靶向CSC群體[19-20]。也有研究表明，DC可用于靶向CSC。通過用衍生自膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的裂解物和致敏的DC進(jìn)行疫苗接種，引發(fā)的T細(xì)胞能夠選擇性靶向CSC。與乙醛脫氫酶（ALDHhigh）CSC裂解物致敏的DC相比，黑素瘤和鱗狀細(xì)胞癌模型中未分離的全細(xì)胞裂解物致敏的DC明顯誘導(dǎo)更高的保護(hù)性抗腫瘤免疫性。本研究結(jié)果表明，與用貼壁細(xì)胞的裂解物致敏的DC相比，細(xì)胞球裂解物致敏的DC明顯刺激了CTL，獲得更高的細(xì)胞毒性。BSC-CTL組對細(xì)胞球細(xì)胞的細(xì)胞毒性與貼壁細(xì)胞差異無統(tǒng)計學(xué)意義，且與Blank-CTL組比較差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義。此外，還發(fā)現(xiàn)BAC-CTL組對貼壁細(xì)胞的細(xì)胞毒性明顯高于細(xì)胞球細(xì)胞。可見，用BSC致敏的DC接種后的優(yōu)異的免疫應(yīng)答刺激了Th1應(yīng)答，可能由于抗原特異性CTL的靶細(xì)胞識別有所改善。

圖5 乳腺癌細(xì)胞球和貼壁細(xì)胞裂解物致敏分離DC活化的CTL對BSC、BAC的細(xì)胞毒性（a：BSC與BAC裂解物致敏分離DC對BSC的細(xì)胞毒性；b：BSC與BAC致敏分離DC對BSC的細(xì)胞毒性；c：BAC致敏分析DC對BSC、BAC的細(xì)胞毒性，均不存在抗原；d：BAC裂解物和無抗原分別致敏，檢測DC對BSC、BAC的細(xì)胞毒性；*P＜0.05）

圖6 BSC-CTL組、BAC-CTL組和Blank-CTL組乳腺癌細(xì)胞球細(xì)胞通過IFN-γELISPOT分析產(chǎn)生點圖（a：BSC-CTL組；b：BAC-CTL組；c：Blank-CTL 組）

圖7 BSC-CTL組、BAC-CTL組和Blank-CTL組的IFN-γ ELISPOT結(jié)果（a：斑點計數(shù)的井區(qū)分析；b：覆蓋面積的井區(qū)分析）

使用IFN-γ ELISPOT測定分析建立的CTL克隆，證實腫瘤抗原負(fù)載的DC明顯誘導(dǎo)IFN-γ產(chǎn)生[21-22]。本研究結(jié)果表明，使用BSC裂解液的DC疫苗接種可以誘導(dǎo)IFN-γ產(chǎn)生，與刺激的CTL數(shù)量呈正相關(guān)。提高E∶T的比例與CTL的斑點計數(shù)及覆蓋面積增加有關(guān)。通過斑點計數(shù)、覆蓋面積的比較，BSC-CTL組的IFN-γ產(chǎn)生高于BAC-CTL組；BSC-CTL組、BAC-CTL組的IFN-γ產(chǎn)生明顯高于Blank-CTL組。DC誘導(dǎo)的IFN-γ產(chǎn)生可能是由進(jìn)一步刺激Th1應(yīng)答的抗原特異性CTL激活引起的。

綜上所述，乳腺癌細(xì)胞球細(xì)胞具有干細(xì)胞特性和強致瘤功能，使用BSC抗原的DC接種可引發(fā)有效的抗原特異性Th1應(yīng)答，進(jìn)一步激活抗原特異性CTL并誘導(dǎo)IFN-γ產(chǎn)生。由此可見，BSC的DC疫苗具有優(yōu)異的抗腫瘤免疫力，有助于BSC特異性免疫治療和癌癥疫苗的開發(fā)。

[1]Mowers EE,Sharifi MN,MacLeod KF．Functions of autophagy in the tumor microenvironment and cancer metastasis[J]．FEBS J,2018．doi:10．1111/febs．14388．[Epub ahead of print]

[2]Flüh C,Chitadze G,Adamski V,et al．NKG2D ligands in glioma stem-like cells:expression in situ and in vitro[J]．Histochem Cell Biol,2018,149(3):219-233．doi:10．1007/s00418-018-1633-5．

[3]Wang Y,Li C,Li Y,et al．Involvement of breast cancer stem cells in tumor angiogenesis[J]．Oncol Lett,2017,14(6):8150-8155．doi:10．3892/ol．2017．7238．

[4]Jiao X,Velasco-Velázquez MA,Wang M,et al．CCR5 governs DNA damage and breast cancer stem cell expansion[J]．Cancer Res,2018,78(7):1657-1671．doi:10．1158/0008-5472．CAN-17-0915．

[5]Moody RR,Lo MC,Meagher JL,et al．Probing the interaction between the histone methyltransferase/deacetylase subunit RBBP4/7 and the transcription factor BCL11A in epigenetic complexes[J]．J Biol Chem,2017,293(6):2125-2136．doi:10．1074/jbc．M117．811463．

[6]Sopper S,Mustjoki S,White D,et al．Reduced CD62L Expression on T Cells and Increased Soluble CD62L Levels Predict Molecular Response to Tyrosine Kinase Inhibitor Therapy in Early Chronic-Phase Chronic Myelogenous Leukemia[J]．J Clin Oncol,2017,35(2):175-184．doi:10．1200/JCO．2016．67．0893．

[7]Richtig E,Trapp M,Kapfhammer HP,et al．The Importance of a Biopsychosocial Approach in Melanoma ResearchExperiences from a Single-center Multidisciplinary Melanoma Working Group in Middle-Europe[J]．Acta Derm Venereol,2016,96(217):51-54．doi:10．2340/00015555-2426．

[8]Jia XH,Feng GW,Wang ZL,et al．Activation of mesenchymal stem cells by macrophages promotes tumor progression through immune suppressive effects[J]．Oncotarget,2016,7(15):20934-20944．doi:10．18632/oncotarget．8064．

[9]Ye B,Smerin D,Gao Q,et al．High-throughput sequencing of the immune repertoire in oncology:Applications for clinical diagnosis,monitoring,and immunotherapies[J]．Cancer Lett,2018,416:42-56．doi:10．1016/j．canlet．2017．12．017．

[10]Salmaninejad A,Zamani MR,Pourvahedi M,et al．Cancer/Testis Antigens:Expression,Regulation,Tumor Invasion,and Use in Immunotherapy of Cancers[J]．Immunol Invest,2016,45(7):619-640．doi:10．1080/08820139．2016．1197241．

[11]Lv D,Hu Z,Lu L,et al．Three-dimensional cell culture:A powerful tool in tumor research and drug discovery[J]．Oncol Lett,2017,14(6):6999-7010．doi:10．3892/ol．2017．7134．

[12]Guttin A,Ipas H,Barbado M,et al．The Yin and Yang of microRNA Assay Methods[J]．Microrna,2016,5(3):201-210．doi:10．2174/2211536605666160725130028．

[13]Wang S,Cai Y．Identification of the functional alteration signatures across different cancer types with support vector machine and feature analysis[J]．Biochim Biophys Acta,2017．doi:10．1016/j．bbadis．2017．12．026．[Epub ahead of print]

[14]Christie C,Madsen SJ,Peng Q,et al．Photothermal Therapy Employing Gold Nanoparticle-Loaded Macrophages as Delivery Vehicles:Comparing the Efficiency of Nanoshells Versus Nanorods[J]．J Environ Pathol Toxicol Oncol,2017,36(3):229-235．doi:10．1615/JEnvironPatholToxicolOncol．2017021545．

[15]Wang P,Guan Q,Zhou D,et al．miR-21 Inhibitors Modulate Biological Functions of Gastric Cancer Cells via PTEN/PI3K/mTOR Pathway[J]．DNA Cell Biol,2018,37(1):38-45．doi:10．1089/dna．2017．3922．

[16]Zheng LT,Zhao LD,Zhao C,et al．Effect of serum interleukin-21 on B cell secretory capacity and apoptosis in patients with systemic lupus erythematosus[J]．China Medical Abstracts(Internal Medicine),2017,56(2):116-120．doi:10．3760/cma．j．issn．0578-1426．

[17]du PWJ,Keyser A,Walzl G,et al．Phenotypic analysis of peripheral B cell populations during Mycobacterium tuberculosis infection and disease[J]．J Inflamm(Lond),2016,13:23．doi:10．1186/s12950-016-0133-4．

[18]Zhuo SM,Li SC,Lin YQ,et al．The effects of anti-Fas ribozyme on T lymphocyte apoptosis in mice model with chronic obstructive pulmonary disease[J]．Iran J Basic Med Sci,2017,20(10):1102-1108．doi:10．22038/IJBMS．2017．9367．

[22]Panahi G,Pasalar P,Zare M,et al．High glucose induces inflammatory responses in HepG2 cells via the oxidative stress-mediated activation of NF-κB,and MAPK pathways in HepG2 cells[J]．Arch Physiol Biochem,2018．doi:10．1080/13813455．2018．1427764．[Epub ahead of print]

[23]Lin G,Li C,Huang C,et al．Co-expression of NF-κB-p65 and phosphorylated NF-κB-p105 is associated with poor prognosis in surgically resectable non-small cell lung cancer[J]．J Cell Mol Med,2018,22(3):1923-1930．doi:10．1111/jcmm．13476．

[24]Nakanishi Y,Sato T,Takahashi K,et al．IFN-γ-dependent epigenetic regulation instructs colitogenic monocyte/macrophage lineage differentiation in vivo[J]．Mucosal Immunol,2018．doi:10．1038/mi．2017．104．

[25]Boland L,Burand AJ,Brown AJ,et al．IFN-γ and TNF-α Pre-licensing Protects Mesenchymal Stromal Cells from the Pro-inflammatory Effects of Palmitate[J]．Mol Ther,2017,26(3):860-873．doi:10．1016/j．ymthe．2017．12．013．