擴心方對擴張型心肌病大鼠肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶及受磷蛋白的影響＊

樊 華，楊愛玲，王佑華，彭瓏萍，叢麗燁，苑素云，曹 敏，鄧 兵，周 端

（上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院心內科 上海 200032）

擴張型心肌?。―ilated cardiomyopathy，DCM）屬原發(fā)性混合型心肌病的一種[1]，國內流行病學調查發(fā)現(xiàn)DCM的5年病死率為15-50%。該病主要表現(xiàn)為左心室、右心室或雙側心室增大，伴有心肌肥厚，心肌收縮功能減退，伴或不伴有心力衰竭（Heart Failure，HF）。臨床主要表現(xiàn)為低射血分數(shù)值、進行性心衰、惡性心律失常、血栓栓塞、心源性休克及猝死等，并可發(fā)生于疾病發(fā)展過程中的任何階段[2]，是導致心衰的主要病因之一[3]。治療集中在抗心衰、抗心律失常及抗凝等對癥治療，缺乏針對性的治療，而中醫(yī)對該病的治療在調整心功能、改善臨床癥狀及提高生存率等方面有一定的優(yōu)勢[4]。諸多研究表明，心肌細胞內的Ca2+濃度或鈣穩(wěn)態(tài)對心肌舒縮功能起著重要的調節(jié)作用，心肌肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶（SERCA2α）及受磷蛋白（PLB）等作為肌漿網(wǎng)鈣調控相關蛋白，對此過程發(fā)揮著重要的作用，故對這一環(huán)節(jié)的深入研究，對闡明DCM發(fā)病機制、提高DCM的臨床療效具有重要意義。

擴心方是我院周端教授的經(jīng)驗方，該方由生黃芪、黃精、丹參、桂枝、瓜蔞皮、黃荊子等中藥組成，在臨床上用于治療擴張型心肌病多年，長期作為院內協(xié)定方應用于臨床擴心病治療。前期[5]的臨床研究發(fā)現(xiàn)，擴心方可明顯改善心功能及臨床癥狀，提高患者生活質量，收到良好效果，但其作用機制不明，有待深入研究價值。本研究通過觀察擴心方對阿霉素誘導的擴張型心肌病模型大鼠心功能、心肌病理及心肌肌漿網(wǎng)鈣調控相關基因、蛋白的影響，初步探討擴心方治療擴張型心肌病的作用機制，為擴心方研究與應用提供實驗依據(jù)。報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康雄性Wistar大鼠60只，SPF級，體重（200±20）g，由上海中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供，動物許可證號：SCXK（京）2012-0001。飼養(yǎng)條件：室溫22-24℃，相對濕度50%-60%，12 h/12 h明暗。

1.2 儀器與藥物

1.2.1 儀器

GEViVid7型超聲儀及12 L高頻淺表探頭（美國通用電氣公司）、RM2016病理切片機（德國Leica公司）、7300熒光定量PCR儀（美國ABI公司）、Rt2100c酶標檢測儀（中國Rayto公司）、neofuge 13R冷凍離心機（中國力康公司）、日本尼康光學顯微鏡。

1.2.2 藥物

阿霉素（ADR）（深圳萬樂藥業(yè)有限公司生產，產品批號:1703E1;規(guī)格:10 mg/瓶），4℃保存；擴心方（由生黃芪、黃精、丹參、桂枝、瓜蔞皮、黃荊子等組成，以水煎煮、真空濃縮、噴霧干燥、干式制粒）臨用前用蒸餾水溶解;卡托普利為中美上海施貴寶制藥有限公司生產（國藥準字H31022986）；戊巴比妥鈉，4%多聚甲醛溶液，蘇木素-伊紅染液，RNA提取液（塞維爾生物科技有限公司，貨號G3013），SERCA2a、PLB、GAPDH引物（擎科創(chuàng)新生物科技有限公司，貨號分別為NM_001110139.2、NM_001110139.2、NM_001110139.2），兔抗大鼠SERCA2a、PLB、GAPDH抗體（Abcam公司，貨號分別為ab150435，ab85146，ab181602），HRP標記的羊抗兔IgG（CST公司，貨號7074S）。

1.3 分組與造模

動物在屏障系統(tǒng)環(huán)境下適應性飼養(yǎng)一周。用隨機數(shù)字表法將60只大鼠分為6組（n=10）:即正常組，模型組，擴心方低、中、高劑量組及卡托普利組。根據(jù)常規(guī)DCM大鼠模型制備方法[6]，將ADR用生理鹽水配成1 mg·mL-1溶液，50只造模大鼠均腹腔注射ADR2.5 mg/(kg·week)，正常組10只大鼠腹腔注射等量的生理鹽水，共6周（阿霉素的累積劑量達到15 mg·kg-1）。造模前各組隨機取3只做心臟超聲，檢測左室射血分數(shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）、左室舒張期末徑（left ventricular internal diastolic diameter，LVIDD）、左室收縮期末徑（left ventricular internal systolic diameter，LVIDS）、左室短軸縮短率（fraction shortening，F(xiàn)S），各組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。注射ADR 4周后，60只大鼠均做心超，造模組與正常組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），即造模成功。

1.4 給藥

從注射ADR第5周開始灌胃給藥，根據(jù)體表面積換算法換算法得出：卡托普利組劑量為5 mg/kg/天，用蒸餾水配成10 mg·mL-1溶液；擴心方中劑量為3.6 g/kg/天，低劑量為中劑量的1/2，即1.8 g/kg/天，高劑量為中劑量的2倍，即7.2 g/kg/天，用蒸餾水配成1 g·mL-1的溶液；正常組和模型組給予與中劑量組等量的生理鹽水，每天上午灌胃1次，連續(xù)給藥4周。

1.5 指標檢測及方法

1.5.1 超聲心動圖檢測

分別在造模前、造模4周后及給藥4周后，大鼠使用氣體麻醉系統(tǒng)進行麻醉，取仰臥位，心前區(qū)備皮，采用多功能超聲診斷儀，用頻率為6-12 MHz的探頭進行檢測。取胸骨旁左室長軸切面、心臟四腔切面和M型超聲心動圖，分別測量LVIDD、LVIDS、EF、FS，取3個心動周期求平均值。

1.5.2 病理學檢測

以戊巴比妥鈉按40 mg·kg-1對大鼠進行麻醉，開胸取心臟后，分離左心室部分，將其分為心尖部與心底部，心尖部組織置于-80℃冰箱保存中用于PCR、Western blotting檢測；心底部組織置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h以上，進行脫水、浸蠟、石蠟包埋、切片，經(jīng)HE染色觀察心肌組織的形態(tài)學改變。

1.5.3 SERCA2α及PLB mRNA表達水平的RT-PCR半定量測定

SERCA2α、PLB、GAPDH（內參照）引物序列間表1。取-80°保存的大鼠心尖部組織剪成100 mg左右大小組織塊，采用Trizol一步法提取mRNA，測定其濃度后，按二步法進行RT-PCR反應。

1.5.4 SERCA2α及PLB蛋白表達水平的Western-blot半定量測定

取100 mg左右組織塊提取蛋白。以BCA蛋白定量試劑盒定量各組蛋白濃度；進行10%SDS-PAGE凝膠電泳分離目的蛋白;將目的蛋白轉移至PVDF膜上;5%脫脂奶粉封閉；分別孵育兔抗大鼠SERCA2α多克隆抗體（1∶1 000）、PLB多克隆抗體（1∶1 000）、GAPDH（1∶2 000）抗體4℃過夜；最后用HRP標記的山羊抗兔IgG（1∶2 000）孵育2 h。使用ECL顯色試劑盒曝光顯影。

表1 目的基因和內參基因的引物序列及擴增條件

表2 各組心臟超聲比較（s）

表2 各組心臟超聲比較（s）

與正常組比較，#P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05

FS(%)52.66±8.58 31.10±4.47#40.75±5.92*39.50±6.97*42.36±8.69*34.98±2.65*組別正常組模型組擴心方低劑量擴心方中劑量擴心方高劑量卡托普利組n 10 7 9 1 0 9 9 LVIDD(mm)6.64±0.54 7.78±0.39#7.34±0.27 7.22±0.70 6.52±0.74*6.95±0.35*LVIDS(mm)3.34±0.70 5.22±0.33#3.95±0.57*3.99±0.36*3.84±0.71*4.71±0.27*EF(%)82.55±6.38 56.97±6.43#69.83±7.14*66.70±7.35*71.16±9.86*62.48±3.52*

圖1 各組大鼠超聲心動圖檢測結果

1.6 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學處理，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）方式表示，兩組均數(shù)比較用配對t檢驗分析，多個樣本均數(shù)間兩兩比較用q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般情況

隨著給藥劑量的累積，注射ADR的大鼠逐漸出現(xiàn)精神不振，毛發(fā)雜亂，體重增加減慢等表現(xiàn)，第4周開始，部分大鼠出現(xiàn)腹水，腹瀉；正常組大鼠反應靈敏，毛發(fā)光澤，體重增長迅速；第8周實驗結束時，正常組和擴心方中劑量組全部存活，擴心方低、高劑量組及卡托普利組均死亡1只，模型組死亡3只。死亡大鼠行尸體解剖發(fā)現(xiàn)，存在肝大、胸水、腹水、腹腔內臟器粘連等現(xiàn)象。

2.2 各組大鼠超聲心動圖檢測結果比較

各組大鼠超聲心動圖檢測結果比較（表2，圖1）與正常組相比，模型組的大鼠LVIDD及LVIDS值升高，EF及FS值降低（P＜0.05），提示造模成功；與模型組大鼠相比，擴心方高、中、低及卡托普利組大鼠LVIDD、LVIDS值降低，EF、FS值升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.3 各組大鼠心肌細胞病理學改變比較

各組大鼠心肌細胞病理學改變比較（圖2）HE染色（圖2A）可見，正常組心肌細胞形態(tài)規(guī)則，心肌纖維排列整齊，心肌間質無增生。模型組（圖2B）出現(xiàn)心肌細胞肥大，間質增生，炎性細胞浸潤，細胞排列紊亂，局部斷裂，有出血和炎癥等病理改變。經(jīng)過治療后，各組染色（圖2C-F）可見心肌細胞肥大、間質增生、炎癥細胞浸潤、排列紊亂等表現(xiàn)均較模型組有所改善。上述病理表現(xiàn)提示擴心方治療對于心肌重塑有改善作用，可有效緩解DCM心肌肥大、壞死、纖維化等改變。

圖2 各組大鼠心肌細胞病理學改變比較

2.4 各組大鼠SERCA2α及PLB mRNA表達比較

各組大鼠SERCA2α及PLB mRNA表達比較（圖3）與正常組相比，模型組SERCA2α的mRNA水平顯著下降（P＜0.05），經(jīng)擴心方各劑量及卡托普利干預后，DCM大鼠SERCA2α的mRNA水平均顯著升高（各治療組vs模型組，均有P＜0.05）；模型組PLBd的mRNA水平較正常組顯著上升（P＜0.05）;而經(jīng)治療后，PLB的mRNA水平顯著降低（各治療組vs模型組，均有P＜0.05）。

圖3 各組大鼠SERCA2α及PLB mRNA表達比較

2.5 各組大鼠SERCA2α和PLB蛋白表達比較

圖4 各組大鼠SERCA2α和PLB蛋白表達比較

各組大鼠SERCA2α和PLB蛋白表達比較（圖4）在分子量100 kD、74 kD處可見清晰的表達條帶。與正常組相比，模型組的SERCA2α條帶明顯變淡變細，而PLB條帶則增粗，經(jīng)擴心方各劑量及卡托普利治療后，條帶分別有不同程度改變。進一步半定量分析顯示，模型組中SERCA2α表達量較正常組降低（P＜0.05），而擴心方各劑量及卡托普利組較模型組SERCA2α表達量則顯著升高（各治療組vs模型組，均有P＜0.05）；模型組中PLB表達量較正常組升高（P＜0.05），而擴心方各劑量組較模型組PLB表達量則顯著降低（各治療組vs模型組，均有P＜0.05）。

3 討論

周端教授提出擴張型心肌病乃先天稟賦不足、后天失養(yǎng)、久病體虛等因素交互作用，導致氣陰虧虛、或陽氣虛衰，心脈痹阻，血運不暢，心體脹大，久則血不利而為水，血瘀痰水停留，亦使心體脹大，從而發(fā)為本病。治以益氣養(yǎng)陰、溫通陽氣，佐以活血化痰利水，設擴心方加減治療，基本方由生黃芪、黃精、丹參、桂枝、瓜蔞皮、黃荊子等組成。全方從整體觀念出發(fā)，標本兼治，黃芪、黃精補益心氣、納氣平喘、滋陰填精以為君;丹參、瓜蔞皮行氣寬胸、活血化瘀以為臣;再佐以桂枝溫陽利水，黃荊子行氣滌痰平喘。擴心方臨床研究表明，其對擴張型心肌病患者的癥狀及心功能改善均有較好的作用，優(yōu)于單純西藥治療，明顯提高生活質量。并且部分患者再入院率明顯下降，提示遠期療效較好。為進一步探討其作用機制，本實驗選用ADR腹腔注射致DCM模型，并予擴心方干預治療。

心肌功能障礙是DCM發(fā)生發(fā)展的一個主要原因，其病理表現(xiàn)以心肌細胞收縮和（或）舒張功能異常為主，Ca2+轉運在此過程中起著至關重要的作用。生物體內的多種鈣調控蛋白均對Ca2+轉運有調控作用，其中，心肌肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶（SERCA2α）是參與鈣離子調節(jié)的主要蛋白之一。本研究探討擴張型心肌病中SERCA2α和PLB的變化及擴心方的干預作用。

SERCA2α的主要功能是將細胞液中的Ca2+攝取到肌漿網(wǎng)中，使細胞液中Ca2+濃度下降，肌漿網(wǎng)中Ca2+儲備升高。若SERCA2α水平降低，肌漿網(wǎng)攝取的Ca2+減少，將直接引起胞漿中Ca2+濃度下降速度減慢，肌漿網(wǎng)Ca2+儲備降低，進而引起兩方面的病理變化:一是降低的Ca2+瞬變峰值會使Ca2+釋放入胞液的速度和量減少，導致心肌收縮功能障礙；二是鈣攝取的下降使得肌漿網(wǎng)不能快速從胞液中攝回Ca2+，故胞質中的Ca2+含量較高，心肌無法充分舒張，導致心肌舒張功能障礙。Jiang Y等[7]的實驗研究證明，SERCA2α的表達對心肌的損傷及預后起著重要作用。我們的實驗也發(fā)現(xiàn)，隨著大鼠心功能的降低，SERCA2αmRNA、蛋白表達水平亦顯著下降，與相關研究的發(fā)現(xiàn)類似[8,9]。

PLB是調節(jié) SERCA2α活性的一個重要蛋白。Tsuji T等[10]研究顯示，PLB的過度表達會導致SERCA2α活性顯著降低。PLB對SERCA2α的抑制作用，會導致肌漿網(wǎng)攝取Ca2+減少，胞漿Ca2+濃度下降速度減慢，肌漿網(wǎng)Ca2+貯存降低，從而使DCM大鼠心臟功能進一步減弱。我們的實驗結果也得出相同的結果，DCM大鼠的PLB mRNA及蛋白水平顯著升高。因此，我們可以通過改善心肌肌漿網(wǎng)鈣調控相關蛋白的表達或活性，如提高SERCA2a的表達，降低PLB的表達，來改善DCM的心功能及臨床癥狀，減少心肌損傷。

我們在研究中發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，擴心方干預治療4周后，DCM大鼠的EF、FS值明顯提高，心肌病理形態(tài)改善明顯，提示擴心方可有效改善DCM大鼠的心功能及心肌損傷，同時，心肌SERCA2αmRNA及蛋白表達升高，PLB mRNA及蛋白表達降低，提示擴心方改善DCM的機制可能與提高心肌肌漿網(wǎng)鈣調控相關蛋白SERCA2α的表達、降低PLB的表達有關。一方面，擴心方通過提高DCM大鼠心肌SERCA2α的表達，改善肌漿網(wǎng)對Ca2+的攝取與儲存功能，從而改善心肌細胞的舒縮功能；另一方面，擴心方通過抑制DCM大鼠心肌PLB的表達，緩解PLB對SERCA2α的抑制作用，間接提高肌漿網(wǎng)鈣泵的攝鈣能力，從而改善心肌細胞舒縮功能。

通過以上研究，我們認為擴心方可通過糾正SERCA2α、PLB mRNA和蛋白表達的異常，改善心肌細胞內Ca2+分布和運轉障礙，恢復Ca2+介導的興奮-收縮偶聯(lián)過程，最終起到改善心功能、減輕心肌損傷的作用。

1 Elliott P,Andersson B,Arbustini E,et al.Classification of the cardiomyopathies:apposition statementfrom statementfrom the European Society of Cardiology Working Group on Myocardial and Pericardial Diseases.EUR Heart J,2008,29(2):270-276.

2 葛均波,徐永健.內科學（第八版）.北京:人民衛(wèi)生出版社,2013:272-276.

3 曹敏,王佑華.中西醫(yī)結合治療心力衰竭理論與實踐（第一版）.北京:科學出版社,2017:2.

4 樊華,居勵之,王佑華.擴張型心肌病的中醫(yī)藥治療進展.中西醫(yī)結合心腦血管病雜志,2017,15(9):1051-1055.

5 王佑華,林赟霄,苑素云,等.擴心方治療擴張型心肌病的臨床療效觀察.上海中醫(yī)藥雜志,2017,51(6):60-62.

6 秦保鋒,嚴世蕓.腹腔注射阿霉素誘導實驗擴張型心肌病大鼠模型的建立.中國實驗診斷學,2012,16(12):2185-2187.

7 Jiang Y,Tian L L,Wang L H,et al.Cardioprotective Effects Of Serca2a Overexpression Against Ischemia-Reperfusion-Induced Injuries In Rats.Curr Gene Ther,2017,3(17):248-258.

8 Boardman N T,Aronsen J M,Louch W E,et al.Impaired left ventricular mechanical and energetic function in mice after cardiomyocyte-specific excision of Serca2.Am J Physiol Heart Circ Physiol,2014,306(7):1018-1024.

9 Wang L,Cui Y,Liu Q,et al.Puerarin Enhances Ca2+Reuptake and Ca2+Content of Sarcoplasmic Reticulum in Murine Embryonic Stem Cell-Derived Cardiomyocytes via Upregulation of SERCA2a.Cell Physiol Biochem,2017,44(3):1199-1212.

10 Tsuji T,Del Monte F,Yoshikawa Y,et al.Rescue of Ca2+overloadinduced left ventricular dysfunction by targeted ablation of phospholamban.Am J Physiol Heart Circ Physiol,2009,296(2):310-317.