保元排毒丸對單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎臟Wnt/β-catenin信號通路的影響＊

王身菊，朱美鳳，鄭宏香，張 玲，陳 岱

（南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬常州市中醫(yī)醫(yī)院 常州 213000）

據(jù)流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果[1]顯示，我國年齡18歲以上的成人慢性腎臟?。–KD）的患病率為10.8%，據(jù)此估算中國現(xiàn)有CKD患者達(dá)到1.2億。CKD的發(fā)病率和病死率逐年升高，目前CKD已成為全球急待解決的健康問題[2]。腎間質(zhì)纖維化（Renal interstitial fibrosis RIF）的嚴(yán)重程度能判斷腎功能受損害程度，對CKD的預(yù)后有決定性作用。延緩和防治腎纖維化是防治慢性腎臟病進(jìn)展的關(guān)鍵。本課題組在以往的臨床實(shí)踐中，采用純中藥制劑保元排毒丸（保元排毒丸由生黃芪、黃精、生曬參、冬蟲夏草、生大黃、六月雪、接骨木、丹參、陳皮、六神曲、木靈芝）治療CKD患者，取得了較滿意的臨床療效[3-5]。本實(shí)驗(yàn)通過制作UUO大鼠腎臟纖維化模型，觀察保元排毒丸對UUO模型大鼠腎臟病理的影響及對Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控，以探討保元排毒丸延緩腎纖維化的機(jī)理。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級健康雄性SD大鼠48只，7-8周，體質(zhì)量190±8 g，購自南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號碼SCXK(蘇)：2016-0002。進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)普通飼料，自由飲水，日常光照。適應(yīng)性飼養(yǎng)3天后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品

保元排毒丸（藥物批號160902）來源于南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬常州市中醫(yī)醫(yī)院制劑室。制作工藝：取生黃芪、黃精、生曬參、冬蟲夏草、陳皮、黃精、六神曲、半量的生大黃共7味中藥混合研成細(xì)粉過80-100目篩備用；另取丹參、六月雪、木靈芝、接骨木及半量生大黃及上述各藥的粗粉共加水煎煮二次，第一次1.5 h，第二次1 h，合并濾液，靜置，取上清液濃縮至相對密度為1.01以上備用。取上述粉末用濃縮液泛丸，丸粒制成梧桐子大小，整粒，60-80℃熱風(fēng)循環(huán)干燥即得。每丸重0.14 g，相當(dāng)于生藥含量0.38 g。厄貝沙坦（商品名：安博維），由賽諾菲杭州制藥有限公司生產(chǎn)，規(guī)格150 mg/片。

1.3 主要試劑

蘇木素-伊紅染液（武漢谷歌生物科技有限公司貨號G1005）、Masson染色試劑盒（武漢谷歌生物科技有限公司 貨號G1006），DAB顯色試劑盒（DAKO）；TRIS（Solarbio T8060），Trizol Reagent、BCA蛋白定量檢測試劑盒及SDS-PAGE凝膠制備試劑盒（武漢塞維爾生物科技有限公司），兔源性E-cadherin抗體（三鷹公司，貨號20874-1-AP），兔源性Ⅰ型膠原抗體（三鷹公司，貨號14695-1-AP），兔源性β-catenin抗體（servicebio，GB11015）；兔源性β-actin（servicebio GB13001-1）。引物設(shè)計(jì)合成（武漢擎科創(chuàng)新生物科技有限公司），Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo K1622）、Fast Start Universal SYBR Green Master(Rox)（Roche 04 913 914 001）、HyPure TMMolecular Biology Grade Water（HyClone SH30538.02）。

1.4 主要儀器

JJ-12J型脫水機(jī)、JB-P5包埋機(jī)（武漢俊杰電子有限公司）、烤箱、RM2016病理切片機(jī)（上海徠卡儀器有限公司）、Nikon Eclipse CI正置光學(xué)顯微鏡。752-P紫外分光光度計(jì)（上?，F(xiàn)科儀器有限公司）、neofuge 15R冷凍離心機(jī)（heal force）、DYY-6C電泳儀（北京六一儀器廠）、alphaEaseFC灰度分析軟件（Alpha Innotech）、Stepone plus熒光定量PCR儀（ABI）、多樣品研磨珠均質(zhì)儀（Omni）。

2 方法

2.1 分組及UUO大鼠模型建立

48只清潔級健康雄性SD大鼠，按隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分六組：假手術(shù)組、UUO組、厄貝沙坦組和保元排毒丸低、中、高劑量組，每組8只。除假手術(shù)組外，其余各組均按文獻(xiàn)[6]方法造模。以3%戊巴比妥鈉，按照0.2mL/100g腹腔注射麻醉，麻醉成功后，固定大鼠，剃去右背部毛發(fā)，暴露皮膚，聚維酮碘消毒皮膚3遍，鋪無菌手術(shù)巾。在距脊柱約1-1.5 cm，肋緣下做長約1-1.5 cm縱行切口，逐層剝離皮下筋膜，切開肌肉，暴露出腎盂及輸尿管，玻璃分針分離出右輸尿管，近腎盂處結(jié)扎輸尿管兩次，從兩結(jié)扎中間剪斷輸尿管，后逐層縫合，關(guān)閉腹腔，以聚維酮碘消毒皮膚切口，用無菌敷料覆蓋包扎。假手術(shù)組只分離右輸尿管，不結(jié)扎，然后逐層縫合。

2.2 給藥

將保元排毒丸溶于蒸餾水中，分別配成濃度為25%、12.5%、6.25%的溶液，放置冰箱冷藏以備用。造模第2天開始給藥，共灌胃14天。保元排毒丸低、中、高劑量組分別給予保元排毒丸1.25g·kg-1/天、2.5g·kg-1/天、5.0g·kg-1/天；厄貝沙坦組：給予厄貝沙坦12.5g·kg-1/天；假手術(shù)組和UUO組給予自由進(jìn)食及等容積生理鹽水灌胃。大鼠給藥劑量參照文獻(xiàn)[7]，低劑量設(shè)為平均臨床等效劑量，中、高劑量分別相當(dāng)于平均臨床等效劑量的2倍和4倍。

2.3 觀察指標(biāo)及檢測方法

2.3.1 腎組織病理

于末次灌胃禁食不禁水24 h后按前法麻醉取右腎，剔除包膜，用無菌紗布吸干水份，電子天平稱取右側(cè)腎臟濕重后，縱切一半右腎置于4%多聚甲醛中固定；右腎另一半分裝于EPP管中于-80℃保存，待進(jìn)一步檢測。固定24 h后，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋，切4.0 μm薄片。按試劑盒方法進(jìn)行HE、Masson染色，顯微鏡下觀察腎臟病理學(xué)改變。HE染色腎小管間質(zhì)損傷按Banff分級進(jìn)行0-3級半定量計(jì)分。記錄連續(xù)不重疊的10個(gè)200倍視野的數(shù)值，取其平均值比較每例切片的腎小管間質(zhì)區(qū)域病變的程度。Masson染色半定量統(tǒng)計(jì)腎間質(zhì)纖維化情況。在光學(xué)顯微鏡200倍高倍鏡下連續(xù)觀察每張切片不重疊的10個(gè)視野，計(jì)算出每個(gè)視野下腎間質(zhì)苯胺藍(lán)染色面積占整個(gè)視野的比例，記錄每張切片的數(shù)值后取其平均值來比較各組腎間質(zhì)纖維化情況。

2.3.2 Western Blot法測腎組織E-cadherin、Collagen I、β-Catenin表達(dá)水平

取保存于-80℃的腎組織，用冷PBS洗滌2-3次，去除血污，剪成小塊置于勻漿器，加入適量裂解液后冰上徹底勻漿。1 500 g離心10 min，收集上清，即為總蛋白溶液，BCA法測蛋白濃度。每上樣孔加4 μg總蛋白行10%SDS-PAGE膠電泳。濕轉(zhuǎn)法電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用封閉液封閉1-2 h后，各組分別加入適當(dāng)稀釋后的 E-cadherin（1∶2000）、Collagen I（1∶1 000）、β-Catenin（1∶1 000）抗體4℃過夜。辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗用TBST稀釋3 000倍，室溫孵育30 min后，用TBST在室溫下脫色搖床上洗三次，每次5 min，化學(xué)發(fā)光劑ECL反應(yīng)5 min，曝光，掃描蛋白條帶，將膠片進(jìn)行掃描存檔，PhotoShop整理去色，Alpha軟件處理系統(tǒng)分析以所測得的各指標(biāo)吸光度與內(nèi)參照β-actin吸光度的比值代表定量值。

圖1 各組大鼠腎組織HE染色（×200）

2.3.3 Real-time PCR檢測Wnt4、β-catenin mRNA表達(dá)

Wnt4、β-catenin的引物設(shè)計(jì)合成由武漢擎科創(chuàng)新生物科技有限公司完成。引物序列：WNT4：正義鏈5′-GGA AGG TGG TGA CAC AAG GGA-3′，反義鏈5′-CAT AGG CGA TGT TGT CCG AGC-3′，片段長度189 bp。β-catenin：正義鏈 5′-TGG TGA AAA TGC TTG GGT CG-3′，反義鏈5′-TCT GAA GGC AGT CTG TCG TAA TAG-3′片段長度189 bp。內(nèi)參GAPDH：正義鏈5′-TTC CTA CCC CCA ATG TAT CCG-3′，反義鏈5′-CATGAGGTCCACCACCCTGTT-3′，片段長度281bp。

提取大鼠腎組織總RNA、應(yīng)用微量核酸分光光度計(jì)檢測總RNA的濃度和純度；以20 μL為體系進(jìn)行cDNA第一鏈的合成，采用熒光定量PCR儀，以25 μL為反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，取0.2 mL PCR管，配制如下反應(yīng)體系（每個(gè)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物配制3管）：2×qPCR Mix12.5 μL、7.5 μM基因引物2.0 μL、反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2.5 μL、dH2O8.0μL。PCR擴(kuò)增：預(yù)變性95℃，10min；循環(huán)（40次）95℃，15 s→60℃，60 s；溶解曲線75℃→95℃，每20 s升溫1℃。反應(yīng)完成后，采用2－△△CT計(jì)算法進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

表1 各組對腎臟病理的影響（HE和Masson評分）

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用spss17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示(sd)，組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，P值小于或等于0.05將被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

保元排毒丸高劑量組在造模過程中因麻醉而死亡一只。

3.1 腎組織HE染色和Masson染色

HE染色：UUO組見大部分腎小管管腔擴(kuò)張明顯，部分可見有蛋白或細(xì)胞管型，腎間質(zhì)彌漫性炎性細(xì)胞浸潤，部分腎小管萎縮或塌陷，部分腎小管上皮細(xì)胞脫落、溶解。保元排毒丸低、中、高劑量組和厄貝沙坦組腎小管輕度擴(kuò)張，腎小管上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)較完整，間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤比UUO組減少（P＜0.01）。厄貝沙坦組與保元排毒丸各劑量組的病理變化大致相當(dāng)（見圖1、表1）。

Masson染色見假手術(shù)組腎小管間質(zhì)、腎小球基底膜、系膜區(qū)無明顯膠原沉積，UUO組見增寬的間質(zhì)有較多藍(lán)紫色條索狀膠原，保元排毒丸各劑量組和厄貝沙坦組藍(lán)紫色膠原沉積明顯少于UUO組（P＜0.01）（計(jì)結(jié)果見圖2、表1）。

圖2 各組大鼠腎組織Msson染色（×200）

3.2 腎組織E-cadherin、Collagen I、β-Catenin表達(dá)水平

如圖3、表2所示，與假手術(shù)組比較，UUO組E-cadherin表達(dá)均明顯減少（P＜0.01），與UUO組比較，保元排毒丸低、中、高劑量組和厄貝沙坦組E-cadherin的表達(dá)增強(qiáng)（P＜0.01）；與假手術(shù)組比較，UUO組Collagen I、β-Catenin表達(dá)顯著升高（P＜0.01）；保元排毒丸低、中、高劑量組和厄貝沙坦組Collagen I、β-Catenin表達(dá)明顯少于UUO組（P＜0.01）。

圖3 各組腎組織E-cadherin、Collagen I、β-Catenin蛋白的表達(dá)

表2 各組E-cadherin、Collagen I、β-Catenin蛋白結(jié)果比較

3.3 Real-time PCR檢測Wnt4、β-catenin mRNA表達(dá)

如表3所示，與假手術(shù)組比較，UUO組和各給藥組Wnt4、β-catenin表達(dá)均明顯升高（P＜0.01）；與UUO組比較，各給藥組Wnt4、β-catenin mRNA表達(dá)明顯低于UUO 組（P＜0.05，P＜0.01），保元排毒丸低劑量組Wnt4的表達(dá)低于厄貝沙坦（P＜0.05）。

表3 各組對大鼠Wnt4、β-catenin mRNA的表達(dá)

4 討論

腎間質(zhì)纖維化（renal interstitial fibrosis，RIF）主要表現(xiàn)為成纖維細(xì)胞的增多及膠原、纖維連接蛋白、層粘連蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)的沉積[8]。RIF的發(fā)生發(fā)展受轉(zhuǎn)化生長因子、結(jié)締組織生長因子等細(xì)胞因子和TGF-β/smad、Wnt/β-catenin等信號通路的調(diào)控，其中，Wnt/βcatenin信號通路在促進(jìn)RIF的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。

正常情況機(jī)體腎臟Wnt信號是沉默的[9]。當(dāng)βcatenin在細(xì)胞核內(nèi)蓄積時(shí)，能激活Wnt信號通路，啟動(dòng)靶基因轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致細(xì)胞增生、侵襲和轉(zhuǎn)移。β-catenin是Wnt/β-catenin信號通路關(guān)鍵的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，是該信號通路激活的標(biāo)志[10]。Surendran等[11]發(fā)現(xiàn)UUO模型中Wnt4在集合管中有表達(dá)，腎小管上皮細(xì)胞胞漿中βcatenin表達(dá)增高。He等[12]證實(shí)UUO模型小鼠腎臟Wnt/β-catenin信號活性明顯增強(qiáng)，Wnt/β-catenin信號通路的激活可促進(jìn)腎纖維化。Villa等[13]表示，在UUO模型中，抑制β-catenin信號通路可減少腎臟纖維化。He等[14]發(fā)現(xiàn)抑制Wnt/β-catenin信號通路可以減少阿霉素腎病小鼠蛋白尿，抑制腎損傷和腎纖維化，均證實(shí)了Wnt信號通路在腎間質(zhì)纖維化中發(fā)揮了重要作用。故本實(shí)驗(yàn)通過UUO模型大鼠觀察保元排毒丸對Wnt4、β-catenin表達(dá)的影響。腎間質(zhì)纖維化的主要成分是Ⅰ型膠原（collagensⅠ，ColⅠ）和Ⅲ型膠原（collagensⅢ，ColⅢ），其mRNA能合理地評估膠原的合成[15]，本實(shí)驗(yàn)選用Ⅰ型膠原的蛋白表達(dá)反映腎間質(zhì)纖維化的程度。

保元排毒丸是全國名老中醫(yī)張志堅(jiān)教授治療CKD及腎纖維化的經(jīng)驗(yàn)方。張老將腎纖維化的病機(jī)歸納為“虛”、“濕”、“瘀”三個(gè)方面，腎元虧虛是腎纖維化始動(dòng)原因，濕熱、濕濁貫穿整過病程中、久病致瘀，濁聚成毒，病機(jī)關(guān)鍵是“腎元虧虛、濕濁毒瘀”，故治療以補(bǔ)益腎元、祛濕化瘀、泄?jié)崤哦緸榉?。保元排毒丸?jù)此病機(jī)治法研制而成，由生黃芪、黃精、生曬參、冬蟲夏草、接骨木、生大黃、六月雪、丹參、陳皮、六神曲、木靈芝組成，為常州市中醫(yī)醫(yī)院使用了三十余年的治療CKD的?？浦苿R床療效可靠[3-5]。方中生黃芪甘溫益氣健脾、補(bǔ)肺固表、利水消腫；黃精甘平，歸肺、脾、腎三經(jīng)，補(bǔ)腎潤肺健脾；生曬參，大補(bǔ)元?dú)?、補(bǔ)脾生津；冬蟲夏草甘溫益氣，益腎補(bǔ)肺，金水同補(bǔ)；四藥共奏補(bǔ)益腎元之功，治病之本。接骨木甘苦平，祛風(fēng)利濕、活血化瘀；六月雪性平偏涼，活血化瘀、通經(jīng)利水、清熱解毒、利濕泄?jié)?；生大黃苦寒瀉下、蕩滌腸胃、解毒化瘀、降泄?jié)嵝埃坏?，苦寒活血祛瘀；四藥共奏祛濕化瘀、泄?jié)崤哦局?，治病之?biāo)。陳皮，補(bǔ)氣健脾、和胃止嘔；六神曲，消食和胃；木靈芝益氣養(yǎng)心安神。諸藥相伍，補(bǔ)益腎元、祛濕化瘀、泄?jié)崤哦?。縱觀全方補(bǔ)泄共施、升降相伍、清消并用，使清得以升，濁得以降，濕得以祛，毒得以解，從而氣機(jī)通順，三焦暢達(dá)。

本實(shí)驗(yàn)HE染色UUO組見大部分腎小管管腔擴(kuò)張明顯、部分可見有蛋白或細(xì)胞管型、腎間質(zhì)彌漫性炎性細(xì)胞浸潤、腎小管萎縮或塌陷、部分腎小管上皮細(xì)胞脫落、溶解；Masson染色見UUO組見增寬的間質(zhì)有較多藍(lán)紫色條索狀膠原。UUO組E-cadherin表達(dá)明顯少于假手術(shù)組和保元排毒丸各劑量組（P＜0.01），提示UUO組腎小管上皮的受損嚴(yán)重。UUO組ColⅠ的表達(dá)明顯高于假手術(shù)組及保元排毒丸各劑量組，提示UUO組纖維化程度重，這說明造模成功。保元排毒丸各劑量組腎小管擴(kuò)張程度輕、腎間質(zhì)病變程度輕、腎間質(zhì)纖維化程度輕，保元排毒丸各劑量組ColⅠ的表達(dá)明顯低于UUO組（P＜0.01），提示保元排毒丸有延緩腎纖維化的作用。

本實(shí)驗(yàn)用Western Blot法和Real-time PCR法均證實(shí)UUO組β-catenin表達(dá)均明顯高于假手術(shù)組（P＜0.01），UUO組Wnt4表達(dá)亦明顯高于假手術(shù)組（P＜0.01）；說明在UUO模型大鼠中，Wnt4和β-catenin的表達(dá)增強(qiáng)，Wnt/β-catenin信號通路被激活，這與文獻(xiàn)報(bào)道符合[16]；經(jīng)過保元排毒丸治療Wnt4和β-catenin表達(dá)均低于UUO組（P＜0.01），提示保元排毒丸能夠下調(diào)Wnt4和β-catenin的表達(dá)，保元排毒丸可能通過抑制Wnt/β-catenin信號通路起到延緩腎纖維化的作用。

厄貝沙坦能減少腎小球細(xì)胞外基質(zhì)蓄積，延緩腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)展[17]，可部分通過下調(diào)β-catenin/Snail的表達(dá)抑制UUO大鼠RIF[18]。本實(shí)驗(yàn)保元排毒丸各劑量組抑制腎纖維化與厄貝沙坦效果相似。本實(shí)驗(yàn)將保元排毒丸設(shè)計(jì)了低、中、高三個(gè)劑量組，低劑量相當(dāng)于平均臨床等效劑量，低、中、高劑量組未見明顯劑量依賴性量效關(guān)系，有可能低劑量是最有效劑量。

綜上所述，在UUO模型大鼠中Wnt4和β-catenin的表達(dá)增強(qiáng)，Wnt/β-catenin信號通路被激活，保元排毒丸可下調(diào)Wnt4和β-catenin的表達(dá)；保元排毒丸有延緩腎纖維化的作用，其機(jī)理可能是通過抑制Wnt/βcatenin信號通路起到延緩腎纖維化的作用。

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