多種統(tǒng)計(jì)方法比較黃連姜制工序中影響生物堿含量的因素＊

王 鑫，袁金鳳，彭詩(shī)濤，張語凡，王 蕾，張先靈，李 飛

（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院 北京 102488）

黃連為毛茛科植物黃連（Coptis chinensis Franch.）、三角葉黃連（Coptis deltoidea C.Y.Cheng et Hsiao.）、云連（Coptis teeta Wall.）的干燥根莖。黃連生品味苦、性寒；具有清熱燥濕、瀉火解毒的作用[1]。姜黃連為黃連的炮制品之一，姜炙后可緩和生品的苦寒之性，善治胃熱嘔吐。歷版藥典和各地炮制規(guī)范[2-15]中姜黃連的炮制工藝不盡相同。其中輔料姜汁的制備工藝有榨生姜汁、煮干姜汁、煮生姜汁；輔料姜汁與黃連飲片有拌勻吸盡和潤(rùn)至透心的不同。生姜味辛性溫，具有溫中止嘔，解表散寒之功；干姜性熱，長(zhǎng)于溫中散寒，回陽(yáng)通脈，有學(xué)者認(rèn)為四川干姜為真正的“藥姜”，不同姜汁對(duì)黃連生物堿的影響未見報(bào)道。故本研究選擇生姜、四川干姜、同批次生姜切片曬干制得的干姜制備姜汁。由于傳統(tǒng)炙法全憑操作者的主觀判斷，不易量化，部分學(xué)者采用烘法替代炙法，兩種加熱方式對(duì)姜黃連的質(zhì)量影響是否一致尚不明確，故采用文獻(xiàn)[16]報(bào)道的姜黃連最優(yōu)烘制工藝，對(duì)傳統(tǒng)炙法和烘法進(jìn)行比較。本實(shí)驗(yàn)通過查閱歷版藥典和各地炮制規(guī)范，發(fā)現(xiàn)姜炙法中姜汁的制備、悶潤(rùn)節(jié)點(diǎn)等工序中各地各法，無規(guī)范化的炮制工藝，不能明確各工序中影響飲片質(zhì)量的因素。這些問題的存在，使得姜黃連飲片的質(zhì)量很難達(dá)到穩(wěn)定、可控，不能保證臨床用藥的安全、有效。故本研究采用同批次黃連片制備姜黃連，在2015版《中國(guó)藥典》規(guī)定的4種生物堿含量標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，以6種生物堿含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，比較不同方法制備的姜汁、悶潤(rùn)程度、姜的來源、加熱方式對(duì)黃連生物堿含量的影響，并采用多種統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行分析，尋找姜制工序中影響姜黃連質(zhì)量的因素，旨在為姜黃連炮制工藝及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的完善提供依據(jù)。

表1 黃連炮制品的制備及外觀性狀

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters 2695高效液相色譜儀（2489紫外檢測(cè)器，Empower色譜工作站）；SB25-12DTDN型超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；SHB-3型循環(huán)多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；BT-25S型電子分析天平（北京賽多利斯儀器有限公司）；AR882+型在線式紅外測(cè)溫儀（深圳市富蘭克儀器儀表有限公司）。

1.2 試藥

鹽酸藥根堿（上海詩(shī)丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司，批號(hào)：ST03080120MG，純度≥98%）；非洲防己堿（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：W30M7Z15501，純度≥98%）；表小檗堿（批號(hào)：PRF8041721，純度≥98%）、鹽酸黃連堿（批號(hào)：PRF7091402，純度≥98%）、鹽酸巴馬?。ㄅ?hào)：PRF8030248，純度≥98%）、鹽酸小檗堿（批號(hào)：PRF8040742，純度≥98%）均購(gòu)自成都普瑞法科技開發(fā)有限公司。乙腈（美國(guó)Fisher公司，色譜純），其余試劑均為分析純。

黃連購(gòu)于北京市雙橋燕京中藥飲片廠，產(chǎn)地為湖北，批號(hào)：1604084。經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院楊瑤珺教授鑒定為毛茛科植物黃連（Coptis chinensis Franch）根莖切成的飲片；干姜購(gòu)于北京市雙橋燕京中藥飲片廠，產(chǎn)地為四川，批號(hào)：1603060；生姜購(gòu)于本地農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

2 方法與結(jié)果

2.1 炮制品的制備

黃連：取黃連飲片，凈制備用，得生品1。

姜汁的制備：分別取生姜、同批次生姜切片曬干制得的干姜（以下簡(jiǎn)稱“干姜”）、四川干姜制備姜汁。三種輔料姜汁的制備方法如下：①榨生姜汁：按2015版《中國(guó)藥典》炮制通則制備[1]；②煮干姜汁：按1988年版《全國(guó)中藥炮制規(guī)范》炮制通則制備[3]；③煮生姜汁：按1990年版《山東省中藥飲片炮制規(guī)范》炮制通則[7]制備。即得不同方法制備的輔料姜汁，備用。

姜制品的制備方法：①姜汁潤(rùn)炙品的制備[3]：取黃連片，加入姜汁拌勻，悶潤(rùn)至透，文火加熱（溫度為95-105℃），炒干；②姜汁拌炙品的制備[1]：取黃連片，加姜汁拌勻至吸盡，置熱鍋內(nèi)，文火（溫度為95-105℃）炒干；③姜汁拌烘品的制備[16]：取黃連片與生姜汁拌勻，悶潤(rùn)60 min后于100℃下烘制3 h。對(duì)各個(gè)樣品進(jìn)行炮制后，觀察其性狀（表1）。

上述炮制品所用的黃連生品均來自同一批次，并在相同溫度下炒干。在姜制品的炮制方法上，主要以1988年版《全國(guó)中藥炮制規(guī)范》的潤(rùn)炙方法為主。同時(shí)，以姜汁拌炙品為對(duì)照比較加輔料潤(rùn)透及吸盡有無區(qū)別；以川姜汁潤(rùn)炙品比較不同來源的姜所制姜汁有無區(qū)別；以清水潤(rùn)炙品為對(duì)照比較加與不加姜汁的黃連潤(rùn)炙品有無區(qū)別；以姜汁拌烘品為對(duì)照比較加熱方式對(duì)黃連姜炙品的影響。分別將上述炮制品粉碎，過2號(hào)篩，備用。

2.2 生物堿含量測(cè)定[17]

2.2.1 色譜條件

XtimateTMC18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相A為30 mmol·L-1碳酸氫銨水溶液（每1 L碳酸氫銨溶液7 mL氨水及1 mL三乙胺），B相為純乙腈，線性梯度洗脫程序?yàn)?-15 min，10-25%B；15-25 min，25-30%B；25-40 min，30-45%B；流速為1 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm；柱溫為30℃；進(jìn)樣量為10 μL。在上述色譜條件下，理論塔板數(shù)按鹽酸藥根堿、鹽酸非洲防己堿、鹽酸表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿峰計(jì)算均不低于10 000。分離度符合含量測(cè)定要求?？瞻讓?duì)照品、混合對(duì)照品及樣品色譜圖見圖1。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱取鹽酸藥根堿、鹽酸非洲防己堿、鹽酸表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿10.44、10.35、9.45、9.39、7.99、9.04 mg，分別置于 10、10、50、25、25、25 mL量瓶中，用甲醇-鹽酸溶液（100∶1）溶解并稀釋至刻度，即得各對(duì)照品儲(chǔ)備液。

分別吸取上述對(duì)照品儲(chǔ)備液鹽酸藥根堿0.5 mL、鹽酸非洲防己堿0.5 mL、鹽酸表小檗堿5.5 mL、鹽酸黃連堿5.0 mL、鹽酸巴馬汀4.5 mL、鹽酸小檗堿18.5 mL于50 mL量瓶中，用甲醇-鹽酸溶液（100∶1）定容至刻度（與儲(chǔ)備液一致），即得混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.2.3 供試品溶液的制備

將制備好的樣品粉末混合均勻，取供試品粉末約0.1 g，精密稱定，置100 mL錐形瓶中，精密加入甲醇-鹽酸溶液（100∶1）50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率：250 W，頻率：40 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇-鹽酸溶液（100∶1）補(bǔ)足減失的重量，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.2.4 線性關(guān)系考察

分別精密量取混合貯備液0.5、1.0、2.5、5、10 mL置10 mL容量瓶中，加甲醇-鹽酸溶液（100∶1）稀釋至刻度，即得不同濃度的系列混合對(duì)照品溶液，分別精密吸取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液及上述混合對(duì)照品溶液各10 μL，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以峰面積積分值（Y）對(duì)各生物堿濃度（mg·L-1）（X）進(jìn)行線性回歸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。鹽酸藥根堿：Y=3.06×107X-7 858.90，r=0.999 9；鹽酸非洲防己堿：Y=4.11×107X-898.49，r=0.999 8；鹽酸表小檗堿：Y=5.17×107X-24 177，r=1.000 0；鹽酸黃連堿：Y=3.89×107X-41 610，rr=0.999 9；鹽酸巴馬?。篩=4.29×107X-20 112，r=1.000 0；鹽酸小檗堿：Y=4.14×107X-84183，r=1.000 0。結(jié)果表明，上述生物堿分別在0.004 4-0.087 3、0.010 2-0.204 1、0.018 0-0.360 6、0.014 4-0.287 6、0.066 2-1.323 5 μg進(jìn)樣量與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取同一混合對(duì)照品溶液，在上述色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄6種生物堿峰面積。計(jì)算得鹽酸藥根堿、鹽酸非洲防己堿、鹽酸表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿峰面積的RSD分別為2.2%，2.8%，1.8%，2.4%，2.4%，1.9%。表明儀器精密度良好。

圖1 空白對(duì)照品（A）、混合對(duì)照品（B）、姜黃連樣品（C）的液相色譜圖

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，室溫放置，分別在0、2、4、8、12、24 h各進(jìn)樣一次，記錄6種生物堿峰面積。計(jì)算得鹽酸藥根堿、鹽酸非洲防己堿、鹽酸表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿峰面積RSD分別為2.4%、2.3%、2.8%、2.1%、1.6%、1.5%。表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取黃連生品粉末，精密稱定6份，按照2.2.3項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)行測(cè)定。鹽酸藥根堿、鹽酸非洲防己堿、鹽酸表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿峰面積RSD分別為2.2%、2.8%、1.8%、2.4%、2.4%、1.9%，重復(fù)性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的黃連生品粉末6份，每份0.05 g，精密稱定，分別精密加入一定量的生物堿混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液，按2.2.3項(xiàng)下方法制成供試品溶液，按上述色譜條件定量測(cè)定。鹽酸藥根堿、鹽酸非洲防己堿、鹽酸表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿的平均回收率分別為97.37%、98.81%、98.03%、102.10%、96.80%、101.42%，RSD分別為2.22%、1.43%、1.59%、1.31%、0.85%、1.63%。

2.2.9 樣品測(cè)定

取黃連及各炮制品粉末，按2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，外標(biāo)法計(jì)算樣品含量，樣品測(cè)定結(jié)果見表2。

由表2可知，黃連經(jīng)姜炙后，表小檗堿、黃連堿含量略有上升，藥根堿、非洲防己堿、巴馬汀、小檗堿含量略有下降。在6種生物堿含量上，傳統(tǒng)姜炙品均高于烘制品。

表2 黃連及各炮制品中6種生物堿的含量（n=3）

表3 黃連姜制品的特征根和方差貢獻(xiàn)率

表4 黃連姜制品的主成分向量

圖2 黃連及各炮制品樣品聚類圖

2.3 數(shù)據(jù)處理

2.3.1 主成分分析

以6種生物堿為指標(biāo)，將黃連姜制品數(shù)據(jù)輸入SAS 9.3進(jìn)行主成分分析，相關(guān)系數(shù)的特征值和方差貢獻(xiàn)率見表3，各主成分對(duì)應(yīng)的特征向量見表4。

由表3可以看出：第1、2、3的主成分的累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為96.79%＞85%。故選擇前3個(gè)主成分進(jìn)行評(píng)價(jià)。它代表了姜黃連中6種生物堿信息量的96.79%。由表4可知，根據(jù)主成分所對(duì)應(yīng)的特征向量，可得前3個(gè)主成分的表達(dá)式為：

由此可見，第一主成分Z1主要受表小檗堿（X3）的影響，第二主成分Z2主要受非洲防己堿（X3）的影響，第三主成分Z3主要受藥根堿（X1）的影響。黃連經(jīng)姜制后各生物堿含量略有變化，經(jīng)主成分分析，不同姜制品之間生物堿含量的差異主要體現(xiàn)在各樣品所含表小檗堿、非洲防己堿、藥根堿含量的不同，故以6種生物堿含量評(píng)價(jià)姜黃連質(zhì)量具有一定科學(xué)性。

2.3.2 聚類分析

以6種生物堿的均值為指標(biāo)，采用SAS 9.3分層聚類分析軟件對(duì)樣品進(jìn)行聚類分析，運(yùn)用歐氏距離（Euclidean）作為樣品的測(cè)度，結(jié)果見圖2。

由圖2可知，當(dāng)歐氏距離λ=4時(shí)，烘法和傳統(tǒng)炙法具有明顯不同的聚類，說明烘品與炙品不同，這可能與加熱方式有關(guān)；λ=2時(shí)，生品和清水炙品為一類，姜炙品為一類，說明輔料姜汁的加入對(duì)黃連產(chǎn)生影響，加輔料與不加輔料是有區(qū)別的。

2.3.3 LSD檢驗(yàn)

以6種生物堿之和為指標(biāo)，采用LSD檢驗(yàn)對(duì)生品及姜制品進(jìn)行兩兩比較，各組數(shù)據(jù)均符合正態(tài)且方差齊。在多個(gè)樣本均數(shù)比較的方差分析中，F(xiàn)=6.28，P=0.000 7，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，總體均數(shù)不全相等。多個(gè)樣本均數(shù)間的多重比較見表5。

表5 黃連及姜制品中6種生物堿之和的多重比較

由表5可知，烘法與炙法具有顯著性差異，而采用傳統(tǒng)炙法炮制的姜炙品之間無顯著性差異。加熱方式可能是影響姜黃連生物堿含量的主要因素，而用不同方法制備的姜汁對(duì)姜黃連的6種生物堿之和影響不大，該結(jié)果與聚類分析的結(jié)果一致。

2.3.4 獨(dú)立t檢驗(yàn)

為了更好的比較榨汁組“姜汁拌炙品”與“姜汁潤(rùn)炙品”有無區(qū)別，選擇獨(dú)立t檢驗(yàn)對(duì)各生物堿進(jìn)行兩兩比較，結(jié)果見表6。

表6 兩組姜黃連中各生物堿的獨(dú)立t檢驗(yàn)

由表6可見，各生物堿的P值均大于0.05，無顯著性差異。在輔料姜汁與黃連飲片拌潤(rùn)的工序中，姜汁與黃連飲片“拌勻吸盡”或“潤(rùn)至透心”在6種生物堿含量上沒有區(qū)別，該結(jié)果與聚類分析及LSD檢驗(yàn)的結(jié)果一致。

3 總結(jié)與討論

3.1 悶潤(rùn)工序中加水量的確定

黃連在姜炙時(shí)，飲片與姜汁悶潤(rùn)至透心，其液體輔料稀釋時(shí)的加水量沒有明確規(guī)定。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。對(duì)悶潤(rùn)工序中的加水量進(jìn)行考察，即：取適量黃連飲片，重量為M，加適量水V1浸泡，待飲片全部潤(rùn)透，內(nèi)無干心時(shí)，過濾，未被吸收的水為V2。則飲片吸水率為：

重復(fù)3次，黃連飲片的平均吸水率為50%，即1 kg黃連飲片吸收的液體量大約為500 mL。根據(jù)黃連飲片吸水率測(cè)定的結(jié)果，量化出其“悶潤(rùn)至透心”時(shí)的加水量，以保證水的加入對(duì)黃連影響的一致性。

3.2 輔料姜的來源對(duì)姜黃連生物堿的影響

有學(xué)者認(rèn)為四川干姜為真正的“藥姜”，本實(shí)驗(yàn)對(duì)四川干姜和生姜曬干姜進(jìn)行比較，聚類分析與LSD檢驗(yàn)均表明兩種姜汁制備的姜黃連在6種生物堿含量上無顯著性差異。

3.3 小結(jié)

本實(shí)驗(yàn)采用同一批次黃連炮制樣品，姜炙法達(dá)到傳統(tǒng)質(zhì)量要求的炒干程度時(shí)，潤(rùn)炙法所需時(shí)間較拌炙法長(zhǎng)，但外觀性狀一致，均符合“表面棕黃色，略有姜的辛辣味”。烘制法炮制的姜黃連顏色較炙法顏色加深，姜辣味淡，焦香氣濃。本研究采用聚類分析、LSD檢驗(yàn)、獨(dú)立t檢驗(yàn)對(duì)6種生物堿含量進(jìn)行分析，結(jié)果表明烘制品與傳統(tǒng)炙品具有明顯差異，烘制品的6種生物堿總量較姜炙品下降10%左右；而傳統(tǒng)炙法中姜的種類、不同方法制備的姜汁及悶潤(rùn)程度對(duì)姜黃連的6種生物堿含量影響不大。鑒于炒炙溫度控制在95-105℃，烘制溫度為100℃，兩種加熱方式溫度基本一致，外觀性狀與成分的差異可能與烘制時(shí)間長(zhǎng)達(dá)3 h有關(guān)。在沒有更多科學(xué)依據(jù)之前，仍應(yīng)采用傳統(tǒng)的姜炙方法制備姜黃連。考慮到若加入姜汁潤(rùn)至透心，則因需加水量大稀釋姜汁，炒干需要的工時(shí)長(zhǎng)，故在加入輔料工序中，輔料姜汁與黃連飲片拌勻吸盡即可。

1 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(四部).北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2015:31.

2 遼寧省衛(wèi)生局.遼寧省中藥炮制規(guī)范.沈陽(yáng):遼寧省衛(wèi)生局,1975:48.

3 衛(wèi)生部藥政管理局.全國(guó)中藥炮制規(guī)范.北京:人民衛(wèi)生出版社,1988:96,113.

4 江西省衛(wèi)生廳藥政管理局.江西省中藥炮制規(guī)范.上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,1991:106.

5 江蘇省衛(wèi)生局.江蘇省中藥飲片炮制規(guī)范.南京:江蘇科學(xué)技術(shù)出版社,1980:105.

6 吉林省衛(wèi)生廳.吉林省中藥炮制標(biāo)準(zhǔn).長(zhǎng)春:吉林科學(xué)技術(shù)出版社,1987,32.

7 山東省衛(wèi)生廳.山東省中藥炮制規(guī)范.濟(jì)南:山東科學(xué)技術(shù)出版社,1990:76.

8 安徽省食品藥品監(jiān)督管理局.安徽省中藥飲片炮制規(guī)范.合肥:安徽科學(xué)技術(shù)出版社,2005:98.

9 浙江省食品藥品監(jiān)督管理局.浙江省中藥炮制規(guī)范.杭州:浙江科學(xué)技術(shù)出版社,2005:124.

10 河南省食品藥品監(jiān)督管理局.河南省中藥飲片炮制規(guī)范.鄭州:河南人民出版社,2005:118.

11 貴州省食品藥品監(jiān)督管理局.貴州省中藥飲片炮制規(guī)范.貴州:貴州科技出版社,2005:222.

12 廣西壯族自治區(qū)食品藥品監(jiān)督管理局.廣西壯族自治區(qū)中藥飲片炮制規(guī)范.南寧:廣西科學(xué)技術(shù)出版社,2007:314.

13 北京市藥品監(jiān)督管理局.北京市中藥飲片炮制規(guī)范.北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2008:226-227.

14 江西省食品藥品監(jiān)督管理局.江西省中藥飲片炮制規(guī)范.上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社,2008:135.

15 湖南省食品藥品監(jiān)督管理局.湖南省中藥飲片炮制規(guī)范.長(zhǎng)沙:湖南科學(xué)技術(shù)出版社,2007:57.

16 王德珍,易駿,張翼,等.酒黃連、姜黃連、萸黃連最佳炮制工藝研究.中藥材,2013,36(1):35-37.

17 耿志鵬,鄭海杰,張藝,等.RP-HPLC測(cè)定不同產(chǎn)地黃連中6種生物堿的含量.中國(guó)中藥雜志,2010,35(19):2576-2580.