高效液相色譜法同時(shí)測定蘋果醋及原料中的17種有機(jī)酸

饒 靜,李春揚(yáng),張曉磊*,王晨慧,尹建軍,宋全厚

(1.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院,北京 100015；2.國家食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心,北京 100015)

以蘋果汁或蘋果濃縮汁為原料,發(fā)酵成蘋果酒,然后接入醋酸菌最終發(fā)酵成蘋果醋［1］。蘋果醋優(yōu)于傳統(tǒng)食醋,兼有水果和食醋的營養(yǎng)保健功能,集營養(yǎng)、保健、食療等功能為一體,其在調(diào)節(jié)新陳代謝、促進(jìn)血液循環(huán)、軟化血管、降低血脂、控制膽固醇水平、抗氧化性等醫(yī)療保健方面都有較好表現(xiàn),消費(fèi)人群也正在逐漸擴(kuò)大［2-3］。有機(jī)酸作為蘋果醋的主要活性成分之一,在國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 30884—2014《蘋果醋飲料》中對(duì)其種類、含量也有明確的規(guī)定,因此準(zhǔn)確測定有機(jī)酸的種類和含量,對(duì)于優(yōu)化蘋果醋發(fā)酵工藝、提高蘋果醋的品質(zhì)具有十分重要的意義。

已報(bào)道對(duì)有機(jī)酸測定的方法很多,包括電位滴定法［4］、分光光度法［5］、離子色譜法［6-7］、氣相色譜法［8-9］、高效液相色譜法［10-12］等。上述方法中,液相色譜法最為靈敏、準(zhǔn)確而得到廣泛運(yùn)用。本研究通過優(yōu)化反相C18柱的色譜條件和前處理?xiàng)l件,建立可同時(shí)分離測定17種有機(jī)酸的高效液相色譜方法,并對(duì)蘋果醋及其生產(chǎn)原料濃縮蘋果汁、蘋果酒中的有機(jī)酸含量進(jìn)行分析,利用統(tǒng)計(jì)分析手段探尋蘋果醋原輔料中有機(jī)酸分布的規(guī)律性,以期為企業(yè)調(diào)整工藝和質(zhì)量控制提供一定的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)和分析手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

標(biāo)準(zhǔn)品：草酸、酒石酸、奎寧酸、甲酸、丙酮酸、蘋果酸、丙二酸、莽草酸、抗壞血酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、馬來酸、富馬酸、琥珀酸、反烏頭酸、丙酸(純度≥98%)：美國Sigma公司；蘋果醋、濃縮蘋果汁和蘋果酒樣品：由企業(yè)提供；甲醇(色譜純)：美國Baker公司；磷酸氫二銨(分析純)：天津市福晨化學(xué)試劑廠；磷酸氫二鉀、磷酸二氫銨、偏磷酸和磷酸(均為分析純)：北京化學(xué)試劑公司；實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q超純水；BNWBOND SAX SPE柱(500 mg/6 mL)和BNWBOND LC-C18SPE(500 mg/6 mL)柱、0.22μm尼龍有機(jī)濾膜：上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；Cleanert NH2-SPE柱(500 mg/6 mL)：天津博納艾杰爾科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters液相色譜儀-2487UVD紫外檢測器：美國Waters公司；Milli-QReference超純水發(fā)生器：美國Millipore公司；AL204-IC萬分之一天平：梅特勒-托利多儀器上海有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別配制10 mg/mL的草酸、酒石酸、奎寧酸、甲酸、丙酮酸、蘋果酸、丙二酸、莽草酸、抗壞血酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、馬來酸、富馬酸、琥珀酸、反烏頭酸、丙酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,于4℃冰箱中保存,使用時(shí)根據(jù)需要用流動(dòng)相逐級(jí)稀釋成適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)混合工作溶液。

1.3.2 樣品前處理方法

蘋果醋：取一定量樣品,流動(dòng)相稀釋10倍后過膜備用。

濃縮蘋果汁和蘋果酒：將C18小柱依次用甲醇、去離子水活化平衡,取樣品2 mL以1 mL/min流速流經(jīng)C18固相萃取預(yù)柱除去色素等干擾物,收集流出液,流動(dòng)相定容至10mL,過膜備用。

1.3.3 色譜條件

InertsilRODS-3色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm)；流動(dòng)相為0.01 mol/L(NH4)2HPO4,pH 2.45,流速：0.5 mL/min；紫外檢測波長210 nm,柱溫30℃,進(jìn)樣量10μL。

1.3.4 測定條件優(yōu)化

考察不同的流動(dòng)相(磷酸二氫銨、磷酸氫二銨、偏磷酸和磷酸氫二鉀)、不同pH(pH 2.30、pH2.45、pH 2.70、pH 3.00和pH 3.50)的流動(dòng)相、不同固相萃取柱對(duì)測定結(jié)果的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 流動(dòng)相的選擇

在液相色譜的分離過程中,有機(jī)酸分子依靠在兩相中分配系數(shù)不同實(shí)現(xiàn)分離。但因有機(jī)酸極性較大,流動(dòng)相中水的比例很高,常發(fā)生酸的解離。為使有機(jī)酸盡可能以分子形式存在,一般使用酸性流動(dòng)相來抑制有機(jī)酸的解離。黃桂穎等［13］比較了不同濃度的磷酸二氫銨、硫酸、磷酸和偏磷酸對(duì)有機(jī)酸分離效果的影響,發(fā)現(xiàn)以偏磷酸作為流動(dòng)相添加劑時(shí)分離效果最佳；高海燕等［14］在以磷酸氫二鉀為緩沖鹽,實(shí)現(xiàn)了11種有機(jī)酸(純草酸、酒石酸、奎寧酸、蘋果酸、莽草酸、抗壞血酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、富馬酸、琥珀酸)的良好分離；王琳等［15］在流動(dòng)相中添加磷酸氫二鈉,對(duì)黃酒中的7種有機(jī)酸(草酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸和琥珀酸)進(jìn)行了分離測定,也取得了較好的結(jié)果。

本實(shí)驗(yàn)在上述文獻(xiàn)方法的基礎(chǔ)上,實(shí)際比較了不同濃度的磷酸二氫銨、磷酸氫二銨、偏磷酸和磷酸氫二鉀對(duì)17種有機(jī)酸分離效果的影響,最終確定0.01mol/L磷酸氫二銨作為本方法的流動(dòng)相條件。

2.2 pH值的選擇

由于所選取的17種有機(jī)酸其pKa值跨度范圍較大,各組分的保留時(shí)間對(duì)流動(dòng)相的pH值非常敏感,這給色譜分離造成了一定的困難。通過優(yōu)化流動(dòng)相的pH值條件,以期使17種有機(jī)酸在流動(dòng)相中均以一種形式存在,達(dá)到最佳的分離定量效果?？紤]到一般色譜柱要求,使用的流動(dòng)相pH值范圍2≤pH≤9,在分離測定一元弱酸時(shí),流動(dòng)相緩沖液的pH值范圍應(yīng)為2≤pH≤pKa-2；如果弱酸的pKa≤4,常需要利用酸的共軛堿測定其含量,則流動(dòng)相緩沖液pH值范圍應(yīng)為pKa+2≤pH≤9。而針對(duì)多元弱酸來說,只要提高流動(dòng)相緩沖溶液的緩沖容量,按關(guān)系式2≤pH≤pKa1-1選擇流動(dòng)相pH值,比較能得到滿意的結(jié)果［16］。本實(shí)驗(yàn)依據(jù)各種有機(jī)酸的解離常數(shù)pKa,以不同pH值(pH 2.30、pH 2.45、pH 2.70、pH 3.00和pH 3.50)的0.01 mol/L(NH4)2HPO4溶液作為流動(dòng)相,比較其對(duì)有機(jī)酸分離效果的影響,結(jié)果見圖1。

由圖1可知,流動(dòng)相pH值對(duì)有機(jī)酸的分離影響很大。當(dāng)pH值為2.30時(shí),乙酸和檸檬水完全不能分開；當(dāng)pH值為2.70時(shí),甲酸和奎寧酸無法分離,抗壞血酸和乳酸分離度也不理想；當(dāng)pH值為2.70時(shí),檸檬酸和富馬酸、酒石酸和奎寧酸不能有效分離；當(dāng)pH值為3.00時(shí),蘋果酸、莽草酸和抗壞血酸未能分離開；當(dāng)pH值為3.50時(shí),不但蘋果酸、莽草酸和抗壞血酸沒有得到改善,甲酸和奎寧酸也無法分離,最終選擇pH2.45作為最適實(shí)驗(yàn)條件。

2.3 SPE柱條件的優(yōu)化

由于蘋果汁和蘋果酒中存在較多的干擾組分,必需經(jīng)過SPE處理以達(dá)到凈化富集的目的。參考文獻(xiàn)方法［17］,比較了BNWBOND LC-C18SPE、Cleanert NH2-SPE和BNWBOND SAX SPE三款固相萃取柱對(duì)樣品的凈化效果,結(jié)果見圖2。結(jié)果表明,同一樣品經(jīng)三種萃取柱后分別進(jìn)樣HPLC分析,Cleanert NH2-SPE和BNWBOND SAX SPE柱對(duì)有機(jī)酸的保留性不強(qiáng),部分目標(biāo)物隨淋洗液流出而損失,回收率低,而BNWBOND LC-C18SPE柱能較好地保留目標(biāo)物質(zhì),因此選擇BNWBOND LC-C18SPE柱。

圖2 不同固相萃取柱對(duì)回收率的影響Fig.2 Effects of different solid phase extraction column on recovery rate

2.4 線性范圍、檢出限和定量限

將17種有機(jī)酸的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用流動(dòng)相稀釋成一定濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,并在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行分析測定,以目標(biāo)化合物的峰面積(y)為縱坐標(biāo),有機(jī)酸質(zhì)量濃度(x,mg/L)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。以S/N=3和S/N=10分別確定各有機(jī)酸在樣品中的檢出限(limit of detection,LOD)和定量限(limit of quantitation,LOQ),結(jié)果見表1。

表1 17種有機(jī)酸的線性關(guān)系、檢出限(S/N=3)和定量限(S/N=10)Table 1 Linear relationships,limits of detection(S/N=3)and limits of quantification(S/N=10)of the 17 organic acids

由表1可知,除去莽草酸(R2為0.998 7)和乳酸(R2為0.998 3)之外,其他化合物的相關(guān)系數(shù)(R2)均＞0.999,說明各有機(jī)酸組分在一定濃度范圍內(nèi)具有較好的線性關(guān)系；方法的LOD為0.01～0.50 mg/L,LOQ為0.03～1.67 mg/L,表明所建立的方法靈敏度較高,可對(duì)有機(jī)酸含量較低的樣品進(jìn)行檢測。

2.5 回收率及精密度

采用3水平加標(biāo)方式,對(duì)蘋果醋、濃縮蘋果汁和蘋果酒三種不同樣品進(jìn)行加標(biāo)回收率試驗(yàn),每一加標(biāo)水平平行測定6次,計(jì)算平均回收率結(jié)果見表2。由表2可知,17種有機(jī)酸的平均加標(biāo)回收率為74.3%～107.3%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)為2.0%～7.0%。表明該方法各有機(jī)酸的回收率較為穩(wěn)定,精密度良好,可以滿足三種不同基質(zhì)樣品中17種有機(jī)酸的同時(shí)測定。

表2 17種有機(jī)酸的加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 2 Adding standard recovery rate and RSD of the 17 organic acids

續(xù)表

2.6 實(shí)際樣品分析

按照上述方法,對(duì)由企業(yè)提供的蘋果醋、濃縮蘋果汁和蘋果酒三類各5個(gè)樣品進(jìn)行了有機(jī)酸含量的檢測,每個(gè)樣品重復(fù)3次。17種混合標(biāo)準(zhǔn)品以及三類不同樣品中有機(jī)酸分析的液相色譜圖見圖3。

由圖3可知,三類樣品中檢出的有機(jī)酸包括酒石酸、蘋果酸、莽草酸、乳酸、乙酸、檸檬酸和琥珀酸等,但不同樣品之間在有機(jī)酸組成及含量上存在明顯差別。濃縮蘋果汁樣品中的有機(jī)酸主要以蘋果酸和乳酸的形式存在,其中蘋果酸含量最為豐富(18 g/L左右)；蘋果酒中依然以蘋果酸和乳酸為主,但含量水平比蘋果汁明顯降低。蘋果醋樣品中以乙酸為最主要的有機(jī)酸成分(含量高達(dá)60 g/L),其次還含有一定量的蘋果酸(1 g/L左右)和琥珀酸(0.5 g/L左右),乳酸未檢出。

利用主成分分析,考察三類樣品中有機(jī)酸含量分布的規(guī)律性特點(diǎn)。7種有機(jī)酸組分經(jīng)過分析提取了2個(gè)主成分,并得到各主成分在不同變量下的載荷矩陣表(表4),載荷系數(shù)絕對(duì)值的大小即表明其對(duì)相應(yīng)主成分的貢獻(xiàn)率大小。

圖4為各樣品在兩個(gè)主成分因子上的得分分布圖,圖中代表不同種類樣品的各點(diǎn)聚集在各自特定的區(qū)域內(nèi),說明蘋果醋和濃縮蘋果汁、蘋果酒在有機(jī)酸含量上具有顯著差異。其中,濃縮蘋果汁各點(diǎn)集中分布在X軸的正半軸,與另外兩種樣品有明顯區(qū)別,因?yàn)槠湓谥鞒煞忠蜃?代表的蘋果酸(載荷系數(shù)0.976)、乳酸(載荷系數(shù)0.651)、檸檬酸(載荷系數(shù)0.969)組分上有非常高的含量；同為X軸負(fù)半軸上的蘋果醋和蘋果酒在Y軸的分布上差異明顯,考察具體數(shù)據(jù),因?yàn)閮煞N產(chǎn)品在主成分因子2中載荷系數(shù)最大的乙酸(載荷系數(shù)-0.948)含量上存在較大差別。

圖3 17種混合標(biāo)準(zhǔn)品以及不同樣品中有機(jī)酸分析液相色譜圖Fig.3 Chromatograms of 17 organic acids standard mixtures and different samples analysis by LC

表3 樣品中有機(jī)酸的測定結(jié)果(n=3)Table 3 Determination results of organic acids in samples(n=3)mg/L

表4 主成分因子載荷矩陣Table 4 Rotated coefficient matrix of principal component factor

圖4 主成分因子得分圖Fig.4 Score plot of principal component factor

3 結(jié)論

本研究通過優(yōu)化前處理?xiàng)l件和色譜條件,建立了一種能夠同時(shí)測定蘋果醋中17種有機(jī)酸的高效液相色譜方法。該方法可有效去除雜質(zhì)干擾,且具有快速、便捷、準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn),可用于蘋果醋類產(chǎn)品中有機(jī)酸的準(zhǔn)確測定。

采用所建立的方法對(duì)蘋果醋及其原輔料濃縮蘋果汁、蘋果酒中有機(jī)酸的含量特征進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),原料濃縮蘋果汁中有機(jī)酸種類豐富,以蘋果酸最為突出,乳酸和檸檬酸等也具有一定的含量；發(fā)酵成蘋果酒后,有機(jī)酸以蘋果酸和乳酸為主要形式；最終產(chǎn)品蘋果醋中,乳酸完全被消耗,蘋果酸含量繼續(xù)下降,有機(jī)酸主要以乙酸的形式存在。

參考文獻(xiàn)：

［1］熊賢平,高洪波,羅培余.雙柱串聯(lián)反相高效液相色譜測定蘋果醋中的有機(jī)酸［J］.食品工業(yè)科技,2016,37(21)：299-303.

［2］李軍鵬,付彩霞,王應(yīng)喜,等.蜜柑果醋的風(fēng)味物質(zhì)成分分析［J］.中國釀造,2015,34(11)：154-157.

［3］姚玉靜,龔慧雯,王爾茂.果醋的保健功能［J］.綜述與評(píng)述,2009,12(9)：1-2.

［4］張 奇,葉正良,李德坤,等.電位滴定法測定五味子提取物中總有機(jī)酸的含量［J］.陜西中醫(yī),2011,32(3)：342-343.

［5］牛金剛,梁曉靜,劉 霞,等.分光光度法測定水溶液中的有機(jī)酸含量［J］.應(yīng)用化學(xué),2010,27(3)：342-346.

［6］戴達(dá)勇,楊英桂,賀萬鑫.離子色譜法同時(shí)測定沙棘果粉中7種有機(jī)酸含量［J］.理化檢測(化學(xué)分冊(cè)),2015,51(3)：304-306.

［7］王貴雙,唐坤甜,魯 緋,等.離子交換色譜法測定食醋中有機(jī)酸［J］.中國釀造,2010,29(7)：166-168.

［8］張 偉,李曉君,張 靜,等.柱前衍生-氣相色譜法同時(shí)測定功能食品中 8 種有機(jī)酸［J］.分析試驗(yàn)室,2014,33(2)：175-179.

［9］張 霞,劉志華,楊光宇,等.固相萃取富集/氣相色譜法測定煙草中的9 種有機(jī)酸［J］.分析測試學(xué)報(bào),2014,33(5)：545-550.

［10］郭 燕,梁 俊,李敏敏,等.高效液相色譜法測定蘋果果實(shí)中的有機(jī)酸［J］.食品科學(xué),2012,33(2)：227-230.

［11］薛 霞,霍艷敏,王 駿,等.固相萃取-高效液相色譜法測定果醋中的 7 種有機(jī)酸［J］.食品科學(xué),2012,33(14)：247-250.

［12］徐玉濤,李珂珂,王賀新,等.高效液相色譜法對(duì)藍(lán)莓果實(shí)中8個(gè)有機(jī)酸含量的測定［J］.食品科學(xué),2015,36(18)：127-131.

［13］黃桂穎,白衛(wèi)東,楊幼慧,等.反相高效液相色譜法測定荔枝肉中10種有機(jī)酸［J］.現(xiàn)代食品科技,2009,25(5)：568-570.

［14］高海燕,廖小軍,王善廣,等.反相高效液相色譜法測定果汁中11種有機(jī)酸條件的優(yōu)化［J］.分析化學(xué)研究簡報(bào),2004,32(12)：1645-1648.

［15］王 琳,陳 雙,徐 巖.固相萃取-超高效液相色譜法測定黃酒中的有機(jī)酸［J］.食品與發(fā)酵工業(yè),2016,42(10)：142-148.

［16］楊 毅,李 崎,陳 蘊(yùn),等.反相高效液相色譜法(RP-HPLC)測定啤酒中有機(jī)酸［J］.食品與發(fā)酵工業(yè),2003,29(8)：6-12.

［17］余永建,鄧曉陽,陸震鳴,等.固態(tài)發(fā)酵食醋有機(jī)酸組成分析中樣品預(yù)處理方法的研究［J］.食品工業(yè)科技,2013,34(4)：198-201.