不同有機(jī)氮源對(duì)發(fā)酵法生產(chǎn)肌苷影響的研究

何 峰,李 科,張曉紅,陳亭亭,楊 薇,項(xiàng) 俊*

(1.經(jīng)濟(jì)林木種質(zhì)改良與資源綜合利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北 黃岡 438000；2.大別山特色資源開(kāi)發(fā)湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心,湖北 黃岡 438000)

肌苷又名次黃嘌呤核苷(inosine,IR),學(xué)名9-β-D-吠喃核糖次黃嘌呤核苷,是一類(lèi)由次黃嘌呤與核糖形成的核苷類(lèi)化合物。其分子式為C10H12NO5,分子質(zhì)量為268.23［1］。在食品工業(yè)中,肌苷是合成5′-肌苷酸二鈉(disodiumeinosine-5′-monophosphate,IMP)最重要的前體物質(zhì),而5′-肌苷酸二鈉和5′-鳥(niǎo)苷酸二鈉(I+G)是新一代安全的增鮮劑與營(yíng)養(yǎng)劑——雞精的主要成分,廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)中［2-4］。肌苷是在人體中發(fā)現(xiàn)的化合物,在遺傳密碼正確翻譯時(shí)必不可少［5-7］。在醫(yī)藥工業(yè)中,肌苷參與人體的能量代謝和物質(zhì)代謝,是僅有的可以代替人類(lèi)自身三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)的藥物。肌苷也是多種抗病毒核苷類(lèi)藥物的前體物質(zhì)。在醫(yī)療方面主要用于醫(yī)治白細(xì)胞和血小板的減少、活化肝功能、提高細(xì)胞內(nèi)ATP水平等［8］,可以治療肝臟、心臟、血細(xì)胞以及視網(wǎng)膜等方面的疾病［9］。

肌苷的生產(chǎn)方法有菌體自溶法、發(fā)酵法和酶水解核糖核酸(ribonucleic acid,RNA)法,由于菌體自溶法和酶水解RNA法產(chǎn)量低,提取困難,而發(fā)酵法具有周期短、易控制、易提取和成本低的優(yōu)點(diǎn)。因此,廠家大多采用發(fā)酵法生產(chǎn)肌苷［10-12］。

目前,發(fā)酵法生產(chǎn)肌苷采用的菌種多為經(jīng)過(guò)基因工程改造的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)［13］,其對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的要求非常高,稍有變化,就會(huì)大大影響肌苷的發(fā)酵水平和發(fā)酵產(chǎn)量的穩(wěn)定性。絕大多數(shù)生產(chǎn)企業(yè)采用淀粉水解后的葡萄糖作為碳源,無(wú)機(jī)鹽是市售工業(yè)級(jí)產(chǎn)品,這些發(fā)酵培養(yǎng)基的組分參數(shù)比較容易控制。相對(duì)而言,不同生產(chǎn)企業(yè)采用的有機(jī)氮源各不相同,即使是同一氮源不同廠家的產(chǎn)品技術(shù)參數(shù)也有差異,而生產(chǎn)企業(yè)在采購(gòu)有機(jī)氮源時(shí)往往容易忽視其差異性,從而導(dǎo)致肌苷發(fā)酵過(guò)程及肌苷產(chǎn)量的不穩(wěn)定［14］。

本試驗(yàn)以枯草芽孢桿菌(B.subtilis)HX1026為研究對(duì)象,選擇大豆蛋白胨、酵母粉、玉米漿干粉和豆粕水解液為有機(jī)氮源,考察不同有機(jī)氮源對(duì)菌株HX1026發(fā)酵過(guò)程中生物量、殘?zhí)呛亢图≤债a(chǎn)量的影響,確定最適合菌株HX1026發(fā)酵生產(chǎn)肌苷的有機(jī)氮源；通過(guò)20 L發(fā)酵罐進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),并監(jiān)測(cè)菌株HX1026發(fā)酵過(guò)程中肌苷晶體的形成過(guò)程,以期為大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)肌苷過(guò)程中制定有機(jī)氮源的選擇標(biāo)準(zhǔn)奠定基礎(chǔ),確保發(fā)酵過(guò)程中肌苷產(chǎn)量的穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枯草芽孢桿菌(B.subtilis)HX1026：由菌株ATCC13952經(jīng)過(guò)基因工程改造并多次誘變選育得到,現(xiàn)保藏于黃岡師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院。

葡萄糖：市售淀粉在實(shí)驗(yàn)室中自行水解制備,水解后葡萄糖含量為32.5%；KH2PO4、FeSO4、MgSO4(均為分析純)：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；大豆蛋白胨(soybean peptone,SP)：山東青州市啟迪生物科技有限公司；豆粕水解液(soybean meal hydrolyzate,SMH)：購(gòu)買(mǎi)市售飼料級(jí)豆粕在實(shí)驗(yàn)室中自行水解制備；工業(yè)豆粕水解液：分別購(gòu)于山東、河南、湖北,編號(hào)為山東1號(hào)、山東2號(hào)、河南1號(hào)、湖北1號(hào)；酵母粉(yeast powder,YP)、酵母抽提物：安琪酵母股份有限公司；玉米漿干粉(corn steep liquor powder,CP)：上海西王淀粉糖有限公司。

種子培養(yǎng)基：淀粉水解葡萄糖2%,酵母抽提物1%,硫酸銨0.5%,氯化鈉0.5%,磷酸二氫鉀0.3%,0.1MPa滅菌20min,滅菌后pH值6.8～7.0。

發(fā)酵基本培養(yǎng)基：葡萄糖20%,硫酸銨1%,磷酸二氫鉀0.3%,硫酸鎂0.5%,腺苷0.025%。在搖瓶培養(yǎng)過(guò)程中采用0.1 MPa滅菌20 min,滅菌后pH值6.8～7.0。在發(fā)酵罐培養(yǎng)過(guò)程中采用原位滅菌,滅菌后pH值6.8～7.0。

有機(jī)氮源采用不同濃度梯度的大豆蛋白胨、酵母粉、玉米漿干粉和豆粕水解液。

1.2 儀器與設(shè)備

20 L自動(dòng)控制發(fā)酵罐：德國(guó)B.Braun公司；Agilent 1260 Infinity II高效液相色譜儀(high performance liquid chromatography,HPLC)：美國(guó)安捷倫科技有限公司；B5100紫外分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；5B-6D型智能型氨基酸態(tài)氮測(cè)定儀(V8版)：北京連華環(huán)?？萍迹籅asler Power Pack顯微鏡相機(jī)：德國(guó)Basler公司；SKD-1000凱氏定氮儀：上海沛歐分析儀器有限公司；SGD-Ⅳ型全自動(dòng)還原糖測(cè)定儀：山東省科學(xué)院生物技術(shù)研究中心；ZWYR-2102C立式雙層恒溫?fù)u床：上海智城分析儀器制造有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 發(fā)酵法制備肌苷工藝流程

將斜面B.subtilis HX1026種子活化后接種至搖瓶中,200 r/min、30℃恒溫培養(yǎng)36 h,培養(yǎng)過(guò)程中在波長(zhǎng)600 nm處檢測(cè)培養(yǎng)液的光密度(optical density,OD),當(dāng)OD600nm達(dá)到0.5～0.6時(shí),以5%的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中,200r/min、30℃恒溫培養(yǎng)60 h。

1.3.2 檢測(cè)方法

采用凱氏定氮法測(cè)定氮源的總氮［15］；高效液相色譜法測(cè)定肌苷含量［16-18］；采用分光光度法測(cè)定菌體生物量,以O(shè)D600nm值表示［19］。發(fā)酵液中糖含量用殘?zhí)?residual sugar,RS)表示,并采用SGD-Ⅳ型全自動(dòng)還原糖測(cè)定儀測(cè)定其含量［20］；采用甲醛滴定法檢測(cè)氨基酸態(tài)氮［21］。

1.3.3 有機(jī)氮源對(duì)菌株HX1026肌苷產(chǎn)量的影響

選取4種氮源：大豆蛋白胨、酵母粉、玉米漿干粉和自制豆粕水解液,總氮含量分別為8.0%、7.2%、4.5%和3.0%。每種氮源分別設(shè)置3種不同的濃度梯度,每種濃度梯度的不同氮源的總氮是相同的。分別添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶發(fā)酵,通過(guò)比較在總氮相同的情況下,檢測(cè)不同種類(lèi)、不同濃度的氮源對(duì)應(yīng)的肌苷產(chǎn)量,以確定最適有機(jī)氮源及其添加濃度。實(shí)驗(yàn)方案見(jiàn)表1。

表1 不同種類(lèi)、濃度的氮源Table 1 Different types and concentrations of nitrogen sources

1.3.4 有機(jī)氮源對(duì)菌株HX1026生物量和殘?zhí)呛康挠绊?/p>

分別選取1.3.3節(jié)中肌苷產(chǎn)量最高的氮源濃度添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中,在其他培養(yǎng)基組分、培養(yǎng)條件不變的情況下,在發(fā)酵過(guò)程中,每4 h測(cè)定菌體生物量、發(fā)酵液中殘?zhí)呛?考察不同種類(lèi)的氮源對(duì)菌株HX1026生長(zhǎng)的影響以及菌株HX1026發(fā)酵過(guò)程中利用糖的情況。

1.3.5 不同廠家豆粕水解液對(duì)肌苷產(chǎn)量的影響

選擇山東1號(hào)、山東2號(hào)、河南1號(hào)、湖北1號(hào)4個(gè)編號(hào)的工業(yè)豆粕水解液,測(cè)定其總氮、氨基酸態(tài)氮、氨基酸態(tài)氮/總氮,并以1.3.3節(jié)中確定的肌苷產(chǎn)量最高濃度的豆粕水解液作為氮源,其他條件都不變,考察4個(gè)不同廠家的豆粕水解液對(duì)肌苷產(chǎn)量的影響。

1.3.6 20 L發(fā)酵罐驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

將培養(yǎng)好的菌株HX1026種子按照10%的接種量接種到20 L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵,發(fā)酵罐裝液量為15 L。發(fā)酵條件為：攪拌轉(zhuǎn)速800 r/min,通氣量為22.5 dm3/min,培養(yǎng)溫度30℃、發(fā)酵過(guò)程中pH 7.0,培養(yǎng)時(shí)間60 h。以1.3.5中選擇的最佳濃度的豆粕水解液作為發(fā)酵培養(yǎng)的有機(jī)氮源,每4 h取樣,分別檢測(cè)菌體生物量、殘?zhí)呛亢图≤债a(chǎn)量。

1.3.7 發(fā)酵過(guò)程中肌苷晶體形成過(guò)程

每4 h從發(fā)酵罐中取樣,將樣品涂布在載玻片上,自然風(fēng)干,利用顯微鏡觀察不同時(shí)間肌苷晶體的形成過(guò)程,進(jìn)一步確認(rèn)山東1號(hào)豆粕水解液是否適合于肌苷晶體形成。

2 結(jié)果與分析

2.1 有機(jī)氮源對(duì)肌苷產(chǎn)量的影響

考察不同有機(jī)氮源對(duì)肌苷產(chǎn)量的影響,結(jié)果如表2所示。由表2可知,以不同濃度的大豆蛋白胨、酵母粉、玉米漿干粉及豆粕水解液作為氮源時(shí),肌苷的產(chǎn)量相差較大。當(dāng)總氮相同時(shí),豆粕水解液作為氮源,肌苷產(chǎn)量最高。當(dāng)豆粕水解液含量為3.6%時(shí),肌苷產(chǎn)量達(dá)到29.6 g/L。因此,可以選擇豆粕水解液作為菌株HX1026發(fā)酵生產(chǎn)肌苷的最佳有機(jī)氮源。

表2 不同濃度的4種有機(jī)氮源對(duì)肌苷產(chǎn)量的影響Table 2 Effects of four nitrogen sources with different concentrations on the yield of inosine

2.2 有機(jī)氮源對(duì)發(fā)酵過(guò)程中HX1026生物量影響

在接種量、其他培養(yǎng)基組分、培養(yǎng)條件相同的情況下,不同濃度的4種有機(jī)氮源在發(fā)酵過(guò)程中對(duì)菌體HX1026生物量的影響如圖1所示。

圖1 不同氮源對(duì)菌株HX102生物量的影響Fig.1 Effects of different nitrogen sources on biomass of strain HX102

由圖1可知,隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),各有機(jī)氮源的菌株生物量均呈先增加后逐漸趨于平穩(wěn)的趨勢(shì),在0～24 h,當(dāng)有機(jī)氮源為豆粕水解液時(shí),菌體生長(zhǎng)極為迅速,生物量(OD600nm值)快速增至0.806；而當(dāng)有機(jī)氮源為大豆蛋白胨、酵母粉、玉米漿干粉時(shí),生長(zhǎng)相對(duì)緩慢,在24 h時(shí)對(duì)應(yīng)的OD600nm值分別是0.610、0.660、0.651。且整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中,豆粕水解液對(duì)應(yīng)的OD600nm值均高于同期的其他3種氮源,說(shuō)明豆粕水解液作為有機(jī)氮源更有利于菌株HX1026菌體的生長(zhǎng)。

2.3 有機(jī)氮源對(duì)發(fā)酵過(guò)程中殘?zhí)呛康挠绊?/h3>

不同有機(jī)氮源對(duì)發(fā)酵過(guò)程中殘?zhí)呛康挠绊懭鐖D2所示。

圖2 不同氮源對(duì)發(fā)酵過(guò)程中殘?zhí)呛康挠绊慒ig.2 Effects of different nitrogen sources on the residual sugar content in the fermentation process

由圖2可知,除玉米漿干粉外,其他有機(jī)氮源發(fā)酵液中殘?zhí)呛侩S著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)先緩慢下降,說(shuō)明菌株利用糖的速度較緩慢,當(dāng)發(fā)酵至16 h后,殘?zhí)呛垦杆傧陆?在相同發(fā)酵時(shí)間點(diǎn),以豆粕水解液為氮源時(shí),糖利用速度略快,到發(fā)酵結(jié)束時(shí)(60 h)殘?zhí)呛繛?.32%,而以大豆蛋白胨和酵母粉為氮源時(shí),殘?zhí)呛糠謩e為3.10%和1.50%；當(dāng)以玉米漿干粉作為氮源時(shí),發(fā)酵前期(0～24 h),菌株對(duì)糖的利用速度非?？?但從32 h后糖利用速度變慢,直到發(fā)酵結(jié)束還有2.90%的殘?zhí)恰Ｒ虼?當(dāng)以豆粕水解液作為氮源時(shí),菌體HX1026利用糖的速度適中,糖利用充分,有利于菌株HX1026發(fā)酵生產(chǎn)肌苷。

2.4 4種有機(jī)氮源技術(shù)參數(shù)測(cè)定

檢測(cè)4種有機(jī)氮源的總氮和氨基酸態(tài)氮含量,并計(jì)算氨基酸態(tài)氮/總氮比值,結(jié)果如表3所示。

表3 4種有機(jī)氮源的氨基酸態(tài)氮和總氮含量比較Table 3 Comparison of amino acid nitrogen and total nitrogen contents of four nitrogen sources

由表3可知,盡管豆粕水解液中的總氮和氨基氮含量均低于大豆蛋白胨、酵母粉和玉米漿干粉,但豆粕水解液的氨基酸態(tài)氮/總氮比值最高,達(dá)到0.623。當(dāng)培養(yǎng)基中總氮含量相同時(shí),豆粕水解液作為氮源的培養(yǎng)基中氨基酸態(tài)氮含量最高,微生物在生長(zhǎng)時(shí)優(yōu)先利用氨基酸態(tài)氮,這可能是菌株HX1026在豆粕水解液中生長(zhǎng)速度最快的原因。當(dāng)發(fā)酵液中氨基酸態(tài)氮消耗完后,菌株HX1026需要產(chǎn)生蛋白酶水解總氮中的非氨基酸態(tài)氮滿(mǎn)足菌株生長(zhǎng)和代謝。大豆蛋白胨、酵母粉、玉米漿干粉總氮含量高,但氨基酸態(tài)氮/總氮比值較低,說(shuō)明這三種氮源中非氨基酸態(tài)氮含量高。因此,在利用這3種氮源進(jìn)行肌苷發(fā)酵的中后期(40～60 h),菌株HX1026生長(zhǎng)速度變慢,殘?zhí)禽^多,肌苷產(chǎn)量較低。結(jié)果說(shuō)明豆粕水解液是菌株HX1026最適合的有機(jī)氮源,同時(shí)也說(shuō)明在選擇有機(jī)氮源時(shí)要兼顧總氮、氨基酸態(tài)氮以及氨基酸態(tài)氮/總氮的比值,確保菌株HX1026發(fā)酵過(guò)程中肌苷產(chǎn)量始終處于較高水平。

2.5 不同廠家豆粕水解液對(duì)肌苷產(chǎn)量的影響

表4 不同廠家豆粕水解液的技術(shù)參數(shù)及對(duì)肌苷產(chǎn)量的影響Table 4 Technical parameters of soybean meal hydrolysate from different factories and the effects on the yield of inosine

由表4可知,不同廠家豆粕水解液的總氮、氨基酸態(tài)氮、氨基酸態(tài)氮/總氮等技術(shù)參數(shù)各不相同,而且對(duì)肌苷產(chǎn)量的影響也存在較大差異。其中,山東1號(hào)的總氮、氨基酸態(tài)氮均高于其他三個(gè)廠家的水解液,其對(duì)應(yīng)的肌苷產(chǎn)量也明顯高,達(dá)到31.2 g/L。山東2號(hào)的氨基酸態(tài)氮/總氮值稍高于山東1號(hào),但豆粕水解液的濃度相同時(shí),其總氮和氨基氮均低于山東1號(hào),其對(duì)應(yīng)的肌苷產(chǎn)量低于山東1號(hào)。因此,在選擇氮源時(shí),不僅氮源種類(lèi)很重要,即使同一種氮源,不同廠家生產(chǎn)的產(chǎn)品技術(shù)參數(shù)如總氮、氨基酸態(tài)氮、氨基酸態(tài)氮/總氮等也存在較大差異,從而導(dǎo)致肌苷產(chǎn)量出現(xiàn)差異。這意味著在選擇豆粕水解液作為肌苷發(fā)酵氮源時(shí),需要建立嚴(yán)格的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),以后在采購(gòu)豆粕水解液時(shí),應(yīng)參照山東1號(hào)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),否則有可能因?yàn)榈吹牟町愑绊懠≤盏漠a(chǎn)量,從而影響肌苷發(fā)酵的穩(wěn)定性。

2.6 20 L發(fā)酵罐驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

以山東1號(hào)為有機(jī)氮源,利用20L發(fā)酵罐對(duì)菌株HX1026發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行驗(yàn)證,考察發(fā)酵過(guò)程中生物量、殘?zhí)呛考凹≤债a(chǎn)量變化,結(jié)果如圖3所示。由圖3可知,菌株HX1026生物量和肌苷產(chǎn)量的變化趨勢(shì)基本一致,從第12小時(shí)開(kāi)始,菌體OD600nm值快速增加,肌苷產(chǎn)量也快速增加,與之相對(duì)應(yīng)的發(fā)酵液中殘?zhí)呛繌牡?2小時(shí)快速減少,發(fā)酵至60 h時(shí)殘?zhí)呛繋缀鯙榱?。在發(fā)酵結(jié)束時(shí),肌苷產(chǎn)量達(dá)到51.2g/L,遠(yuǎn)高于山東1號(hào)在搖瓶發(fā)酵中的產(chǎn)量31.2 g/L。這可能是因?yàn)榘l(fā)酵罐中溶氧充足,快速攪拌使得培養(yǎng)基和菌體傳質(zhì)充分,最終提高了肌苷產(chǎn)量。這進(jìn)一步證實(shí)山東1號(hào)是適合于菌株HX1026的生長(zhǎng)與發(fā)酵生產(chǎn)肌苷的有機(jī)氮源。

圖3 山東1號(hào)豆粕水解液對(duì)B.subtilis HX1026發(fā)酵參數(shù)的影響Fig.3 Effect of Shandong No.1 soybean meal hydrolysate on the fermentation parameters of B.subtilis HX1026

2.7 發(fā)酵過(guò)程中肌苷晶體形態(tài)的變化

以山東1號(hào)為有機(jī)氮源,從20 L發(fā)酵罐中分別于24 h、36 h、48 h和60 h取樣,在顯微鏡下觀察肌苷晶體,結(jié)果如圖4所示。

圖4 發(fā)酵過(guò)程中肌苷晶體形態(tài)變化Fig.4 Changes of the crystal morphology of inosine during fermentation

由圖4可知,在發(fā)酵24 h時(shí),肌苷晶體呈羽毛狀,數(shù)目比較少,晶體比較小,需在1 000倍的顯微鏡下才能看到；當(dāng)發(fā)酵至36 h時(shí),晶體呈絨毛狀,晶體變大,在400倍顯微鏡下就能被觀察到,且晶體數(shù)量明顯增多；當(dāng)發(fā)酵至48 h時(shí),晶體呈雪花狀,在400倍的顯微鏡下晶體非常清晰；當(dāng)發(fā)酵至60 h時(shí),晶體呈放射狀,數(shù)量非常多,在400倍的顯微鏡下清晰可見(jiàn)的肌苷晶體非常粗壯。發(fā)酵過(guò)程中肌苷晶體由小變大、由少變多的過(guò)程流暢、清晰可見(jiàn),結(jié)合20 L發(fā)酵罐中肌苷產(chǎn)量(51.2 g/L),進(jìn)一步說(shuō)明山東1號(hào)是合適的菌株HX1026發(fā)酵生產(chǎn)肌苷的有機(jī)氮源。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以枯草芽孢桿菌HX1026為研究對(duì)象,選擇大豆蛋白胨、酵母粉、玉米漿干粉和豆粕水解液為有機(jī)氮源,考察不同有機(jī)氮源對(duì)菌株HX1026發(fā)酵過(guò)程中生物量、殘?zhí)呛?、肌苷產(chǎn)量的影響,確定了豆粕水解液是最適合于菌株HX1026發(fā)酵生產(chǎn)肌苷的有機(jī)氮源；在此基礎(chǔ)上,研究不同廠家生產(chǎn)的豆粕水解液對(duì)菌株HX1026發(fā)酵過(guò)程中肌苷產(chǎn)量的影響,確定山東1號(hào)豆粕水解液是最適合于菌株HX1026發(fā)酵生產(chǎn)肌苷的有機(jī)氮源；通過(guò)20 L規(guī)模的發(fā)酵罐驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),證實(shí)山東1號(hào)豆粕水解液作為氮源時(shí),菌株HX1026肌苷產(chǎn)量(51.2 g/L)大幅高于搖瓶發(fā)酵(31.2 g/L),且肌苷晶體在發(fā)酵罐中形成過(guò)程清晰可見(jiàn)。因此,豆粕水解液的總氮、氨基酸態(tài)氮、氨基酸態(tài)氮/總氮等技術(shù)參數(shù)可以作為肌苷大規(guī)模發(fā)酵時(shí)選擇有機(jī)氮源的標(biāo)準(zhǔn),以確保氮源的穩(wěn)定性,從而保證發(fā)酵過(guò)程中肌苷產(chǎn)量的穩(wěn)定性,這對(duì)其他晶體類(lèi)產(chǎn)品如鳥(niǎo)苷、核黃素的發(fā)酵過(guò)程中氮源的篩選也有具重要的參考價(jià)值。

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