高效液相色譜法測(cè)食品中的阿斯巴甜新舊國(guó)標(biāo)方法的比對(duì)

/ 上海市浦東食品藥品檢驗(yàn)所

阿斯巴甜(Aspartame)是由天冬氨酸和苯丙氨酸結(jié)合而成的縮二氨酸的甲基酯，作為新型甜味劑逐漸被人們所熟悉，其應(yīng)用范圍正逐漸擴(kuò)大[1]。因?yàn)榘⑺拱吞鹬泻斜奖匪?，不適用于苯丙酮尿癥患者，因此采取科學(xué)方法準(zhǔn)確測(cè)定食品中阿斯巴甜的含量至關(guān)重要[2]。本文通過(guò)對(duì)比新舊國(guó)標(biāo)方法的不同之處，分析新國(guó)標(biāo)方法的先進(jìn)性和科學(xué)性。

1 實(shí)驗(yàn)原理

阿斯巴甜易溶于水、甲醇和乙醇等極性溶劑而不溶于脂溶性溶劑，將不同分類的樣品經(jīng)不同前處理后用水提取阿斯巴甜，提取的溶液注入高效液相色譜儀，經(jīng)反相色譜分離，根據(jù)保留時(shí)間定性和峰面積比較進(jìn)行定量[3][4]。

2 前處理方法的改進(jìn)

2.1 細(xì)化樣品分類

對(duì)于樣品的前處理，目的就是盡量提高目標(biāo)組分的回收率，舊國(guó)標(biāo)GB 22254-2008[5]中，試樣的分類只有碳酸飲料類、乳飲料類、濃縮果汁類以及固體飲料，而新的國(guó)標(biāo)方法GB 5009.263-2016（2017-06-23實(shí)施）[6]不僅包含了舊國(guó)標(biāo)中的這四種類別，還增加了餐桌調(diào)味料、糖果類、乳制品、冷凍飲品、果凍、蔬菜及其制品、水果及其制品、食用菌和藻類、谷物及其制品、焙烤食品、膨化食品、脂肪類乳化制品、可可制品、巧克力及巧克力制品、堅(jiān)果與籽類、水產(chǎn)及其制品和蛋制品。新國(guó)標(biāo)方法將樣品分類更加細(xì)化，提取方法更加科學(xué)，更加完善。其中，新國(guó)標(biāo)將碳酸飲料、濃縮果汁、固體飲料、餐桌調(diào)味料和除膠基糖果以外的其他糖果分為一類，其前處理也較為簡(jiǎn)便。

2.2 對(duì)于樣品的制備，增加勻漿步驟

新國(guó)標(biāo)中對(duì)于乳制品、冷凍飲品、果凍、蔬菜及其制品、水果及其制品、食用菌和藻類、谷物及其制品、焙烤食品、膨化食品、脂肪類乳化制品、可可制品、巧克力及巧克力制品、堅(jiān)果與籽類、水產(chǎn)及其制品和蛋制品這些類別的樣品，均提出在提取前，用食品加工機(jī)按不同的試樣與水的質(zhì)量比進(jìn)行勻漿，而后稱取勻漿試樣進(jìn)行提取測(cè)定。新國(guó)標(biāo)增加勻漿的制備步驟，使樣品在提取過(guò)程中更加快速完全，有效提高目標(biāo)組分的回收率。

2.3 對(duì)果凍中阿斯巴甜的提取單獨(dú)增加了前處理方法

新國(guó)標(biāo)中細(xì)化明確了果凍中阿斯巴甜的提取，果凍基質(zhì)彈滑，較難用舊國(guó)標(biāo)中的方法充分提取，新國(guó)標(biāo)提出勻漿稱樣，并加入80%甲醇水溶液，70 ℃水浴加熱提取，有效提高目標(biāo)組分的回收率。

2.4 前處理中增加了正己烷的使用

新國(guó)標(biāo)中，針對(duì)膠基糖果、脂肪類乳化制品、巧克力及巧克力制品。堅(jiān)果與籽類、水產(chǎn)及其制品、蛋制品這些類別的食品，也分別提出加入正己烷進(jìn)行前處理。舊國(guó)標(biāo)中，此類樣品較難用其規(guī)定的方法充分提取，雜質(zhì)干擾也比較嚴(yán)重，新國(guó)標(biāo)中針對(duì)膠基類、含脂肪類物質(zhì)使用正己烷，正己烷是低毒、無(wú)色的液體，不溶于水，對(duì)膠基類物質(zhì)有很好的溶解能力，也對(duì)脂肪有較好的提取能力。加入正己烷，有效凈化樣品的基質(zhì)干擾以及脂肪的殘留，對(duì)提高目標(biāo)組分的回收率起了很大的作用。

3 色譜條件的改變

新國(guó)標(biāo)中升高了柱溫箱溫度，由25 ℃升至30 ℃；流動(dòng)相增加乙腈-水（20+80）的選擇；檢測(cè)波長(zhǎng)也從208 nm改為200 nm。流動(dòng)相增加乙腈-水（20+80）的選擇，可使檢測(cè)人員在做實(shí)驗(yàn)時(shí)根據(jù)實(shí)驗(yàn)分析條件的不同進(jìn)行優(yōu)化選擇，使色譜條件更加科學(xué)、更加完善。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，相同濃度的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，在相同的試驗(yàn)條件下同時(shí)測(cè)定，200 nm測(cè)定時(shí)的阿斯巴甜響應(yīng)值明顯大于208 nm測(cè)定時(shí)阿斯巴甜的響應(yīng)值，見(jiàn)圖1。

圖1 在200 nm和208 nm測(cè)定時(shí)的阿斯巴甜響應(yīng)值

4 標(biāo)準(zhǔn)溶液系列的制備及有效期

舊國(guó)標(biāo)中阿斯巴甜標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液濃度為1.00 mg/mL，置于冰箱保存，有效期為180 d，其標(biāo)準(zhǔn)使用液的系列濃度為 500 μg/mL、250 μg/mL、125 μg/mL、50.0 μg/mL、25.0 μg/mL， 置于冰箱保存， 有效期為60 d。新國(guó)標(biāo)中，將阿斯巴甜標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液濃度改為0.5 mg/mL，置于4 ℃左右冰箱保存，有效期為90 d，其標(biāo)準(zhǔn)使用液的系列濃度為 100 μg/mL、50 μg/mL、25 μg/mL、10.0 μg/mL、5.0 μg/mL，置于 4 ℃左右冰箱保存，有效期為30 d?？梢钥闯?，舊國(guó)標(biāo)中選取的使用液濃度較大，往往超過(guò)樣品所含阿斯巴甜濃度的數(shù)倍，而新國(guó)標(biāo)中使用液濃度較小，基本涵蓋了樣品中所含阿斯巴甜的濃度，且有效期的縮短，保證了標(biāo)準(zhǔn)使用液的有效性，更加科學(xué)合理。

5 分析結(jié)果的表述

新國(guó)標(biāo)增加了“結(jié)果保留3位有效數(shù)字”的規(guī)定，使方法數(shù)據(jù)結(jié)果更加嚴(yán)謹(jǐn)統(tǒng)一。

6 檢出限和定量限

舊國(guó)標(biāo)中僅粗略規(guī)定樣品稱樣量為5 g、定容體積為25 mL、進(jìn)樣量為20 μL時(shí)，方法檢出限為0.002 g/kg，定量限為0.006 g/kg，而新國(guó)標(biāo)中，根據(jù)樣品類別的不同、前處理方法的不同，分別給定了檢出限與定量限（詳見(jiàn)表1），使方法更加嚴(yán)謹(jǐn)、規(guī)范，更具有科學(xué)性。

表1 新國(guó)標(biāo)中各類食品中阿斯巴甜的檢出限和定量限

7 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

根據(jù)新舊國(guó)標(biāo)對(duì)前處理的改變，選取改動(dòng)較大的果凍及膠基糖果進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。試驗(yàn)步驟如下：選用市售含阿斯巴甜的果凍及膠基糖果-口香糖，分別根據(jù)新舊國(guó)標(biāo)的前處理方法進(jìn)行重復(fù)性對(duì)比驗(yàn)證。

7.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀— Agilent HPLC配DAD檢測(cè)器、恒溫箱、自動(dòng)進(jìn)樣器以及Agilent 化學(xué)工作站；超聲波振蕩器；離心機(jī)：轉(zhuǎn)速≥4 000 r/min；甲醇；正己烷。

7.2 儀器參考條件

色譜柱—CAPCELL PAK C18 MGⅡ S5，4.6 mmI.D.×250 mm；柱溫：30 ℃；流動(dòng)相：甲醇-水（40+60）；流速：0.8 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：200 nm。

7.3 樣品前處理

因舊國(guó)標(biāo)中，對(duì)果凍以及口香糖沒(méi)有明確的前處理方法，故選擇參照固體飲料的前處理步驟。具體條件如表2所示。

表2 新舊國(guó)標(biāo)樣品前處理過(guò)程

7.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

根據(jù)樣品的實(shí)際情況，選取新國(guó)標(biāo)中的濃度范圍配制標(biāo)準(zhǔn)曲線，具體濃度見(jiàn)表3。

表3 新國(guó)標(biāo)中采用的標(biāo)準(zhǔn)曲線系列濃度

阿斯巴甜濃度與峰面積呈正相關(guān)，其線性回歸方程為：y= 55.87 178x，線性相關(guān)系數(shù)R為0.999 6，線性相關(guān)系數(shù)R≥0.999時(shí)可認(rèn)為線性良好。

7.5 試驗(yàn)結(jié)果及重復(fù)性比較

根據(jù)上述試驗(yàn)條件，試驗(yàn)結(jié)果及重復(fù)性比較見(jiàn)表4。

表4 試驗(yàn)結(jié)果及重復(fù)性

試驗(yàn)證明，新國(guó)標(biāo)中對(duì)果凍及膠基糖果（口香糖）前處理方法的改進(jìn)對(duì)阿斯巴甜提取能力有顯著提高。

8 結(jié)語(yǔ)

新國(guó)標(biāo)對(duì)比舊國(guó)標(biāo)，無(wú)論是從樣品的細(xì)化分類、前處理方式方法的改進(jìn)、色譜條件的優(yōu)化、標(biāo)準(zhǔn)曲線的有效性和繪制，還是檢出限與定量限的改變，都有了更科學(xué)、更合理的改進(jìn)，提高了目標(biāo)組分的回收率，細(xì)化了檢出限與定量限，是目前比較完善科學(xué)的阿斯巴甜檢測(cè)方法。

[1]蔣定國(guó)，王竹天，楊大進(jìn)、等.高效液相色譜法測(cè)定食品中阿斯巴甜的含量[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)，2007，17（6）.

[2]宋雁，樊永祥，李寧.阿斯巴甜的安全性評(píng)價(jià)進(jìn)展情況[J].中國(guó)食品衛(wèi)生雜志，2010，22（1）：84-87.

[3]吳燕.高效液相色譜同時(shí)測(cè)定食品中5種添加劑[J].上海預(yù)防醫(yī)學(xué)，2008，20（3）：113-115.

[4]劉郁，劉連新，燕傳勇，等.高效液相色譜測(cè)定茶飲料中的阿斯巴甜含量[J].現(xiàn)代食品科技，2012，28（12）：1810-1812.

[5]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部. GB 22254-2008食品中阿斯巴甜的測(cè)定[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2008.

[6]中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì). GB 5009.263-2016食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中阿斯巴甜和阿力甜的測(cè)定[S]. 北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2016.