長鏈非編碼RNA LOC728290在肝細胞癌患者腫瘤組織中的表達及意義

程思杰，趙娜娜，嚴 錦，王瑞蘭，余靈祥，肖朝輝，雷光林，張培瑞，王兆海，張紹庚，楊鵬輝

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是目前臨床上最常見的惡性腫瘤之一。據(jù)統(tǒng)計，在全球范圍內(nèi)每年大約有74萬新增HCC病例，同時又有70萬HCC死亡病例，其中大約50%發(fā)生在中國[1-2]。由于高發(fā)病率和高病死率，HCC在世界范圍內(nèi)尤為被重視，而我國的HCC發(fā)病率及病死率也呈逐年上升趨勢，高居各種惡性腫瘤相關死亡原因的總體第2位[2-3]，嚴重危害人類健康。HCC的發(fā)生發(fā)展是一個復雜的生物學過程。已有研究表明HCC的發(fā)生發(fā)展與HBV、HCV感染以及感染引起的相關通路變化相關[4-5]；也與多種干細胞生長因子的異常表達引起的信號通路變化密切相關[6-7]。然而，HCC發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移的分子生物學機制至今尚未明確。

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA,LncRNA）是一類不編碼蛋白或只能編碼短肽，轉(zhuǎn)錄本長度一般超過200 nt的非編碼RNA分子，起初被認為是轉(zhuǎn)錄過程中的副產(chǎn)物，無任何生物學功能[8-9]。但是越來越多的研究顯示，LncRNA在基因轉(zhuǎn)錄翻譯、表觀遺傳、細胞分化等生命活動中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用，并且在多種腫瘤中存在異常表達，參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展、浸潤和轉(zhuǎn)移等過程[10-12]，有望成為新的潛在腫瘤標志物和藥物靶標，為腫瘤的診斷和預后提供新的研究思路[13-15]。此外，特異性表達的LncRNA譜可以將癌組織和癌旁組織進行準確判別[16]。因此，本研究基于人類LncRNA公共數(shù)據(jù)庫GSE55191基因數(shù)據(jù)，檢測了LncRNA LOC728290在HCC患者中配對（癌組織、癌旁組織）表達水平差異，并進一步探討LncRNA LOC728290的表達水平與患者臨床病理特征、術后無復發(fā)生存時間的關系，為HCC患者早期診斷及預后提供參考。

1 對象與方法

1.1 標本來源 選取2013年10月—2016年12月于解放軍第三〇二醫(yī)院肝膽外科行肝癌切除術患者65例，患者術前均未接受化療、放療等輔助治療，標本經(jīng)病理分析證實均為HCC。對照組標本來自于同一患者的癌旁組織（距離手術切緣至少3 cm），術后病理檢查未發(fā)現(xiàn)癌細胞。所有標本在離體后立即放入液氮中保存。腫瘤分化程度依據(jù)Edmondson-Steiner分級標準確定，腫瘤分期按美國腫瘤研究聯(lián)合委員會2010年發(fā)布的第7版分期系統(tǒng)的標準確定。

1.2 儀器與試劑 LncRNA LOC728290及GAPDH引物由上海生工生物工程股份有限公司設計及合成；RNA提取試劑Trizol購自美國Life Technologies公司；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒及實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR,qRT-PCR）試劑盒均購自全式金生物科技有限公司；生物分光光度儀購自美國Thermo公司；qRT-PCR儀購自美國Applid Biosystems公司。LncRNA LOC728290引物序列為：5′-ACAGGACTCCATGGCAAACG-3′（正向引物）；5′-ATGAAGAAAGCCTGGTGCAGT-3′（反向引物）。GAPDH：5′-AGAGGCAGGGATGATGTTCTG-3′（正向引物）；5′-GACTCATGACCACAGTCCATGC-3′（反向引物）。

1.3 RNA的提取 取100 mg液氮凍存的肝組織并加1 ml Trizol，用組織勻漿儀研磨，研磨充分后抽提RNA；RNA含量和純度采用核酸蛋白定量檢測儀檢測，RNA純度的判斷采用A260/A280的比值，當該比值為1.8～2.0時認為RNA樣品的純度合格。采用瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性。

1.4 RT-PCR及qRT-PCR 按照反轉(zhuǎn)錄說明書將所提取組織標本RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。按照SYBR Green說明書配制qRT-PCR反應體系。取cDNA進行qRT-PCR，反應條件如下：95 ℃ 30 s預變性，95 ℃ 5 s變性，60℃ 30 s退火，進行40個循環(huán)，每個樣品設3個復孔并進行3次生物學重復，每次都將待測樣品及內(nèi)參同時進行qRT-PCR，基于2-△△Ct的方法進行相對定量分析。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用 SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。采用Wilcoxon秩和檢驗比較LncRNA LOC728290在癌組織和配對癌旁組織的表達水平；LncRNA LOC728290高表達組與低表達組患者臨床病理特征的比較采用χ2檢驗；臨床病理差異患者的LncRNA LOC728290表達水平比較采用Mann-Whitney秩和檢驗；總體生存率采用Kaplan-Meier生存分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 LncRNA LOC728290在HCC患者癌組織及配對癌旁組織中的表達水平 通過qRT-PCR分別檢測65例HCC患者癌組織和配對癌旁組織中LncRNA LOC728290的表達。Wilcoxon秩和檢驗結果表明，LncRNA LOC728290在癌組織中表達量顯著低于配對癌旁組織（t=12.540，P=0.001）（圖1A）；其中54例HCC患者（83.0%）LncRNA LOC728290在癌組織中的表達水平較配對癌旁組織下調(diào)（圖1B）。

圖1 LncRNA LOC728290在HCC患者中癌組織及配對癌旁組織相對表達水平A.LncRNA LOC728290在HCC患者癌組織和配對癌旁組織中的表達水平（n=65）；B.LncRNA LOC728290在HCC患者癌組織較配對癌旁組織的相對表達水平，正數(shù)代表表達量升高，負數(shù)則代表降低Figure 1 Relative expression level of LncRNA LOC728290 in tumor tissues and its paired adjacent tissues of HCC patients

2.2 HCC組織LncRNA LOC728290表達量與患者臨床特征的關系 根據(jù)HCC患者癌組織中LncRNA LOC728290相對表達量的中位數(shù)將65例標本分為LncRNA LOC728290高表達組（n=32）和低表達組（n=33）[17]，通過比較2組患者的臨床特征發(fā)現(xiàn)，LncRNA LOC728290的表達水平與患者性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤數(shù)目、是否有門靜脈癌栓及病理分級之間差異無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）。而LncRNA LOC728290的表達與患者AFP水平及患者是否存在微脈管浸潤差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）（表1）。進一步對AFP水平≥20 ng/m（ln=39）和AFP水平＜20 ng/m（ln=26）標本中LncRNA LOC728290表達量比較分析顯示：血清AFP≥20 ng/ml的患者癌組織中的LncRNA LOC728290的表達水平較血清AFP＜20 ng/ml組患者顯著降低（t=2.421，P=0.021）（圖2A）。對有微脈管浸潤的HCC患者（n=47）和無微脈管浸潤的HCC患者（n=18）標本中LOC728290的表達量檢測結果顯示：微脈管浸潤的HCC患者LncRNA LOC728290顯著低表達（t=2.021，P=0.040）（圖2B）。

2.3 HCC患者癌組織中LncRNA LOC728290表達水平與患者預后的關系 結合臨床患者隨訪信息，分析LncRNA LOC728290的表達水平與HCC患者（n=65）術后無復發(fā)生存率的關系發(fā)現(xiàn)，LncRNA LOC728290表達水平低的HCC患者無復發(fā)生存率較其表達水平高的HCC患者明顯降低，2者差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.047）（圖3）。

3 討 論

HCC是我國最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率及病死率也逐年攀升[18]。越來越多的研究表明LncRNA的異常表達在腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著不可忽視的作用[19-21]。HCC的發(fā)生發(fā)展機制復雜，已有研究表明LncRNA H19、MALAT1和HULC與肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關[22-24]，但其具體作用機制尚不明確?；诖?，本研究首先對數(shù)據(jù)庫中HCC的LncRNA的表達情況進行了統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)LncRNA LOC728290在HCC中顯著低表達，具有成為HCC患者預后標志物的潛力。本研究進一步證實LncRNA LOC728290在65例HCC患者癌組織中較配對癌旁組織表達顯著下調(diào)；同時LncRNA LOC728290表達水平低的HCC患者無復發(fā)生存時間較表達水平高的患者顯著降低，推測LncRNA LOC728290可能參與HCC的發(fā)生發(fā)展過程。由于肝組織的復雜性，HCC患者合并HBV、HCV感染與否，是否具有肝纖維化、肝硬化，門靜脈癌栓或微脈管浸潤等，必然對應不同的細胞內(nèi)信號通路或腫瘤微環(huán)境的改變。因此，LncRNA LOC728290在HCC中表達下降的機制與HCC發(fā)生發(fā)展的具體分子機制還需要后續(xù)的研究來證實。

表1 HCC組織中LncRNA LOC728290高表達組與低表達組臨床指標比較（n=65）Table 1 Comparison of clinical indexes of LncRNA LOC728290 between the high expression group and the low expression group in HCC tissues (n=65)

近年來，隨著直接抗病毒藥物的發(fā)展與應用，即使在不聯(lián)合使用干擾素的情況下，其對慢性肝炎尤其是HCV感染引起的慢性肝炎也取得了良好的治療效果。但直接抗病毒藥物對肝硬化患者和IL-28B抗性基因型患者治療效果卻不盡如人意，患者發(fā)生HCC的幾率仍維持在較高水平[25]，因此探尋新的標志物或潛在靶標的任務仍然非常迫切。近年來，研究表明多種LncRNA（HOTAIR、H19、ZEB1-AS1等）參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，有望作為疾病潛在預后指標[26-28]。本研究，統(tǒng)計分析了LncRNA LOC728290的表達水平與臨床病理資料的相關性，發(fā)現(xiàn)LncRNA LOC728290的表達與患者AFP水平是否＞20 ng/ml及患者是否存在微脈管浸潤有關差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05），血清AFP在肝癌的診斷中發(fā)揮著重要的作用[29-30]，推測LncRNA LOC728290可能是HCC發(fā)生的一個重要標志物；此外還發(fā)現(xiàn)其表達水平與患者微脈管浸潤具有相關性，而微脈管浸潤及門靜脈癌栓是HCC肝外轉(zhuǎn)移的主要途徑[31-32]，由此揭示LncRNA LOC728290在HCC發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，具體的生物學功能、調(diào)控機制還有待深入探究。然而，LncRNA LOC728290的表達水平與患者的性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤數(shù)目、腫瘤分期及是否合并肝硬化等其他臨床病理指標的差異無統(tǒng)計學意義，可能與目前臨床患者樣本量較小、腫瘤異質(zhì)性等因素有關，還須要進一步擴大樣本量驗證該結論。另外，LncRNA LOC728290在不同HCC細胞系的差異表達，其相互作用的靶基因及信號通路以及其在體外細胞模型和體內(nèi)荷瘤裸鼠發(fā)揮的具體功能等還有待進一步研究，以揭示其在HCC發(fā)生發(fā)展中的具體調(diào)控機制；并且進一步隨訪完善患者總生存時間與疾病預后關系，以期使LncRNA LOC728290成為HCC潛在的臨床早期診斷、判斷疾病預后的候選靶標。

圖2 LncRNA LOC728290在AFP水平、有/無微脈管浸潤HCC患者癌組織中的表達量差異A.LncRNA LOC728290在不同AFP水平組中的表達；B.LncRNA LOC728290在有/無微脈管浸潤患者癌組織的表達Figure 2 Differential expression levels of LncRNA LOC728290 in HCC patients with different levels of serum AFP and patients with or without microvascular invasion

圖3 不同LncRNA LOC728290的表達水平與HCC患者術后無復發(fā)生存曲線Figure 3 Correlations between LncRNA LOC728290 expression level and recurrence-free survival of HCC patients

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