CXCR5+CD8+ T細(xì)胞在HIV感染中的免疫特征及其與疾病進(jìn)展關(guān)系的研究

趙 爽，許 文，陳威巍，趙 敏

CXCR5+CD8+T細(xì)胞是一群被新定義的細(xì)胞群。不同于傳統(tǒng)CD8+T細(xì)胞，這群細(xì)胞表達(dá)趨化因子受體CXCR5，通過CXCR5-CXCL13軸趨化其優(yōu)先定植于B細(xì)胞濾泡中，構(gòu)成了濾泡中的大部分CD8+T細(xì)胞，因而有研究將其定義為濾泡細(xì)胞毒性T細(xì)胞（follicular cytotoxic T cells,TFC）[1-4]。在慢性HIV感染期間，病毒復(fù)制集中于次級淋巴濾泡中，其中的濾泡輔助T細(xì)胞（follicular helper T cells,Tfh）是HIV感染和復(fù)制的重要位點(diǎn)[5-6]，傳統(tǒng)的細(xì)胞毒性CD8+T細(xì)胞無法進(jìn)入濾泡中，不能控制定植于淋巴濾泡內(nèi)Tfh中的HIV感染。因此，CXCR5+CD8+T細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)，可能對清除這一重要的HIV病毒庫提供新的治療靶點(diǎn)。

目前，對于CXCR5+CD8+T細(xì)胞在HIV感染疾病進(jìn)程中的作用還存在爭議。有學(xué)者認(rèn)為CXCR5+CD8+T細(xì)胞是CD8+T細(xì)胞中的一群調(diào)節(jié)性細(xì)胞亞群，其在HIV及猴免疫缺陷病毒感染中可抑制Tfh的B細(xì)胞輔助功能，從而損害生發(fā)中心的應(yīng)答，起到類似CD4+濾泡調(diào)節(jié)T細(xì)胞（follicular regulatory T cell,Tfr）的作用，因此定義其為CD8+Tfr[7]。目前對該群細(xì)胞的表型、免疫功能等的研究較少，且現(xiàn)有的研究還存在爭議，其與HIV感染的關(guān)系有待進(jìn)一步深入研究。本文擬對HIV感染中CXCR5+CD8+T細(xì)胞頻率、功能變化及與HIV感染疾病進(jìn)展的相關(guān)性進(jìn)行研究，以探討該群細(xì)胞在HIV感染免疫病理進(jìn)程中發(fā)揮作用的可能機(jī)制。

1 對象與方法

1.1 對象 解放軍第三〇二醫(yī)院2015年10月—2017年5月收治的HIV感染者40例（HIV感染組）及同期體檢的健康者15例（健康對照組）。HIV感染組中，男性35例，女性5例，平均年齡為（34.2±10.2）歲。HIV感染組納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡18～60歲，自愿參加本研究者；②經(jīng)HIV確證試驗(yàn)確診的HIV感染者；③還未開始高效抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療（highly active antiretroviral therapy,HAART）；④無機(jī)會性感染；⑤無高血壓、糖尿病等慢性疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：①妊娠婦女或產(chǎn)褥期婦女；②有其他免疫相關(guān)性疾病或使用免疫抑制劑者。健康對照組中男13例，女2例，平均年齡（38.1±13.1）歲。已排除妊娠婦女、產(chǎn)褥期婦女，以及既往無免疫相關(guān)性疾病或其他基礎(chǔ)疾病者，入組前2周無急性感染性疾病，未使用免疫抑制劑。HIV感染組和健康對照組之間在性別（χ2=0.007，P=0.934）、年齡（t=0.778，P=0.337）方面差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

本研究已獲得我院倫理委員會批準(zhǔn)，入組的所有患者及健康者均簽署知情同意書。

1.2 儀器與試劑 FACS CantoII流式細(xì)胞儀、淋巴細(xì)胞亞群檢測試劑盒、淋巴細(xì)胞絕對計(jì)數(shù)管、CD45-APC/Cy7、CD3-BV510、CD8-Percp/cy5.5單克隆抗體均購自美國BD公司。 CXCR5-FITC、IFN-γ-AF700、IL-10-PE單克隆抗體和固定破膜劑均購自美國Biolegend公司。淋巴細(xì)胞分離液購自德國GE Healthcare公司。HIV載量測定使用的全自動核酸分離純化系統(tǒng)購自德國BIO-RAD公司（CFX96 Real-Time Ststem），HIV核酸定量檢測試劑盒購自德國QIAGEN公司。

1.3 標(biāo)本采集及外周血單個核細(xì)胞分離 采集研究對象清晨空腹外周靜脈血4 ml，EDTA抗凝，使用Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個核細(xì)胞（peripheral blood monocytes,PBMCs）。

1.4 流式細(xì)胞染色

1.4.1 細(xì)胞表面標(biāo)志物染色 將Ficoll密度梯度離心法分離的PBMCs計(jì)數(shù)，取1.0×106個細(xì)胞懸于含2%胎牛血清（fetal calf serum,FBS）的PBS緩沖液中，調(diào)整濃度為2.0×107個/ml。加入預(yù)混目的抗體組合和同型對照抗體組合，振蕩混勻后室溫避光孵育30 min；加入1 ml含2% FBS的PBS緩沖液，混勻后以1500 rpm離心5 min，棄去上清后重復(fù)1次；加入1%多聚甲醛400 μl固定，4 ℃避光存放；待流式細(xì)胞儀檢測。

1.4.2 細(xì)胞因子檢測 將Ficoll密度梯度離心法分離的PBMCs重懸于含有10%FBS的1640培養(yǎng)基并接種于96孔板中，使用50 ng/ml佛波酯和500 ng/ml離子霉素作為激活劑，激活后1 h加入高爾基阻斷劑，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，回收細(xì)胞后加入1 ml含2%FBS的PBS，混勻后以1500 rpm離心5 min，棄去上清并加入固定破膜劑400 μl，4 ℃破膜30 min，其后加入破膜洗液1 ml，1500 rpm離心5 min，棄上清，加入IFN-γ流式抗體，避光孵育30 min，再用1 ml破膜洗液1500 rpm 離心5 min洗滌，加入1%多聚甲醛400 μl固定，4 ℃避光存放；待流式細(xì)胞儀檢測。

1.4.3 流式細(xì)胞分析圈門策略 通過白細(xì)胞共同抗原CD45圈出淋巴細(xì)胞群，其后選定CD3+CD8+T細(xì)胞群，再從其中圈定CXCR5+的細(xì)胞群即CXCR5+CD8+T細(xì)胞，以及IFN-γ+和IL-10+的CXCR5+CD8+T細(xì)胞（見圖1）。

1.5 血漿病毒載量測定 血漿HIV RNA載量檢測采用實(shí)時熒光定量PCR方法，使用全自動核酸分離純化系統(tǒng)（COBAS AMPLICOR）和核酸提取試劑盒，提取病毒RNA并測定病毒載量。操作過程嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。最低檢測下限為40 copies/ml。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料呈正態(tài)分布，以±s表示。2組間均數(shù)的比較采用成組t檢驗(yàn)（組間方差齊）。2組相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 CXCR5+CD8+T細(xì)胞及CXCR5-CD8+T細(xì)胞功能差異 健康對照組中，CXCR5+CD8+T細(xì)胞分泌IFN-γ高于CXCR5-CD8+T細(xì)胞，CXCR5+CD8+T細(xì)胞分泌IL-10也同樣高于CXCR5-CD8+T細(xì)胞（圖2A、B）。HIV感染組中，CXCR5+CD8+T細(xì)胞分泌IFN-γ和IL-10的能力均顯著高于CXCR5-CD8+T細(xì)胞（圖2C、D）。

2.2 HIV感染者CXCR5+CD8+T細(xì)胞頻率及功能變化 流式細(xì)胞分析發(fā)現(xiàn)，HIV感染組患者外周血CXCR5+CD8+T細(xì)胞頻率較健康對照組上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖3A）；2組CXCR5+CD8+T細(xì)胞分泌IFN-γ的能力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖3B）。HIV感染組CXCR5+CD8+T細(xì)胞分泌IL-10的能力較健康對照組明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖3C）。

圖1 CXCR5+CD8+ T細(xì)胞流式分析Figure 1 CXCR5+CD8+ T cell subset analyzed by flow cytometry

圖2 HIV感染組（n=40）及健康對照組（n=15）CXCR5+CD8+ T細(xì)胞和CXCR5-CD8+ T細(xì)胞功能差異A、B.健康對照組CXCR5+CD8+ T細(xì)胞及CXCR5-CD8+ T細(xì)胞IFN-γ及IL-10表達(dá)差異；C、D.HIV感染組CXCR5+CD8+ T細(xì)胞及CXCR5-CD8+ T細(xì)胞IFN-γ及IL-10表達(dá)差異Figure 2 Differences of the function of CXCR5+CD8+ T cells and CXCR5-CD8+ T cells in HIV infected group (n=40) and health control group (n=15)

圖3 HIV感染組（n=40）及健康對照組（n=15）CXCR5+CD8+ T細(xì)胞頻率及功能差異A.2組間CXCR5+CD8+ T細(xì)胞頻率差異；B.2組間CXCR5+CD8+ T細(xì)胞IFN-γ表達(dá)差異；C.2組間CXCR5+CD8+ T細(xì)胞IL-10表達(dá)差異Figure 3 Differences of the frequency and function of CXCR5+CD8+ T cells between HIV infected group (n=40) and health control group (n=15)

2.3 HIV感染者外周血CXCR5+CD8+T細(xì)胞頻率、功能與疾病進(jìn)展的關(guān)系 本研究進(jìn)一步分析HIV感染者外周血CXCR5+CD8+T細(xì)胞頻率與CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)和血漿HIV載量的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，CXCR5+CD8+T細(xì)胞頻率與其外周血CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)呈弱正相關(guān)（圖4A），而與血漿HIV載量呈弱負(fù)相關(guān)（圖4D）；CXCR5+CD8+T細(xì)胞IFN-γ的表達(dá)與其外周血CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)無相關(guān)性（圖4B），與血漿HIV載量呈負(fù)相關(guān)（圖4E）。而CXCR5+CD8+T細(xì)胞IL-10的表達(dá)與外周血CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)呈弱負(fù)相關(guān)（圖4C），與血漿HIV載量呈正相關(guān)（圖4F）。這些數(shù)據(jù)表明外周血CXCR5+CD8+T細(xì)胞頻率及功能與HIV感染者的疾病進(jìn)展密切相關(guān)。

圖4 HIV感染組外周血CD4+ T細(xì)胞計(jì)數(shù)、血漿HIV載量與外周血CXCR5+CD8+ T細(xì)胞頻率及功能的相關(guān)性A、B和C.CD4+ T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)與CXCR5+CD8+ T細(xì)胞頻率、IFN-γ表達(dá)及IL-10表達(dá)的相關(guān)性；D、E和F.血漿HIV載量與CXCR5+CD8+ T細(xì)胞頻率、IFN-γ表達(dá)及IL-10表達(dá)的相關(guān)性Figure 4 Correlation of CD4+ T lymphocyte counts and plasma HIV load with the frequency and function of CXCR5+CD8+ T cells in peripheral blood of HIV infected patients

3 討 論

目前HIV感染中CXCR5+CD8+T細(xì)胞群的免疫特征及其與疾病進(jìn)展的關(guān)系尚不明確。本研究初步探索了CXCR5+CD8+T細(xì)胞的頻率及IFN-γ和IL-10分泌功能，發(fā)現(xiàn)其頻率及功能的變化與疾病的進(jìn)展密切相關(guān)，提示其可能在HIV感染免疫致病機(jī)制中發(fā)揮了重要的作用。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)無論HIV感染者還是健康對照者，CXCR5+CD8+T細(xì)胞分泌IFN-γ的能力均較CXCR5-CD8+T細(xì)胞升高。新近的研究發(fā)現(xiàn)，利用T細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)移治療淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒慢性感染小鼠時，CXCR5+CD8+T細(xì)胞亞群比CXCR5-亞群表現(xiàn)出更好的治療潛力[1]，且在慢性HIV感染中，CXCR5-CD8+T細(xì)胞位于T細(xì)胞區(qū)，受嚴(yán)重原位抑制性微環(huán)境的影響，表現(xiàn)出嚴(yán)重的功能障礙，也稱為耗竭[8]，提示CXCR5+CD8+T細(xì)胞在慢性感染中可能發(fā)揮了更重要的抗病毒作用。本研究發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)治療的HIV感染者中CXCR5+CD8+T細(xì)胞頻率較健康對照組上調(diào)，其IFN-γ的表達(dá)在2組中的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而CXCR5+CD8+T細(xì)胞頻率與外周血CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)呈弱正相關(guān)，而與血漿HIV載量呈弱負(fù)相關(guān)，提示其對HIV感染病程可能起著控制作用。且該群細(xì)胞分泌IFN-γ的能力與血漿HIV載量呈負(fù)相關(guān)，也提示IFN-γ的分泌對控制病毒的復(fù)制發(fā)揮重要作用。

CXCR5+CD8+T細(xì)胞和CXCR5-CD8+T細(xì)胞的基因表達(dá)模式有較大差異[1]。本研究發(fā)現(xiàn)，CXCR5+CD8+T細(xì)胞在HIV感染組和健康對照組中分泌IL-10的能力均顯著高于CXCR5-CD8+T細(xì)胞。CXCR5+CD8+T細(xì)胞群在HIV感染組中相對健康對照組也明顯上調(diào)了IL-10的表達(dá)，且與外周血CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)呈弱負(fù)相關(guān)，與血漿HIV載量呈正相關(guān)。近期研究發(fā)現(xiàn)，CXCR5+CD8+T細(xì)胞可損傷Tfh的功能及生發(fā)中心B細(xì)胞抗體的產(chǎn)生[7]，且既往研究發(fā)現(xiàn)CD8+T細(xì)胞的免疫抑制作用主要依賴于IL-10的分泌[9-10]，提示HIV感染可能通過上調(diào)CXCR5+CD8+T細(xì)胞的IL-10的表達(dá)抑制了生發(fā)中心應(yīng)答，造成了HIV感染者體液免疫損傷，起到類似Tfr的作用[11]。另外也有研究發(fā)現(xiàn)，IL-10+的CD8+T細(xì)胞可通過分泌IL-10抑制IL-10-CD8+T細(xì)胞的增殖及IFN-γ的產(chǎn)生[9，12]。這提示高表達(dá)IL-10的CXCR5+CD8+T細(xì)胞可能也會損害CD8+T細(xì)胞分泌IFN-γ的功能從而抑制其抗病毒作用。以上研究結(jié)果提示，CXCR5+CD8+T細(xì)胞可能在HIV感染中發(fā)揮著復(fù)雜的免疫作用。CXCR5+CD8+T細(xì)胞群分泌較低IL-10和較高IFN-γ水平的HIV感染者，能更好地控制病毒復(fù)制并維持CD4+T細(xì)胞數(shù)量在較高水平。但是，目前對IL-10+CD8+T細(xì)胞發(fā)揮的功能還有爭議，對羊毛硫氨酸合成酶2的研究發(fā)現(xiàn)其激活可能通過上調(diào)CD8+T細(xì)胞IL-10的表達(dá)，促進(jìn)記憶CD4+T細(xì)胞和記憶CD8+T細(xì)胞的成熟，從而促進(jìn)固有免疫向適應(yīng)性免疫的轉(zhuǎn)化[13]。對高表達(dá)IL-10的CXCR5+CD8+T細(xì)胞的功能還須進(jìn)一步深入研究。

HIV病毒庫難以清除是HIV治療的一大障礙。而定植于淋巴濾泡中的Tfh因其對HIV高度易感以及HIV在濾泡中逃避了效應(yīng)CD8+T細(xì)胞的作用而成為難以清除的HIV病毒庫[5，14-15]。因此，進(jìn)一步研究HIV治療性疫苗與PD-1阻斷劑或IL-2的聯(lián)合使用，提高CXCR5+CD8+T細(xì)胞的免疫應(yīng)答能力，可能為實(shí)現(xiàn)Tfh病毒庫的清除提供新的途徑。另外，將HIV特異的廣泛中和抗體轉(zhuǎn)移至非人靈長類及嚙齒類動物中，均能發(fā)揮預(yù)防及治療作用，但HIV感染者中僅有很少一部分能產(chǎn)生廣泛中和抗體[16-17]，Tfh功能的受損可能是其體液免疫功能障礙的最主要原因，阻斷CXCR5+CD8+T細(xì)胞對Tfh及生發(fā)中心B細(xì)胞的抑制作用，可恢復(fù)受損的HIV感染者的體液免疫功能，從而為疫苗誘導(dǎo)廣泛中和抗體的產(chǎn)生提供了可能。

研究已經(jīng)明確CXCR5+CD8+T細(xì)胞主要分布在次級免疫器官中，并發(fā)現(xiàn)其可能在清除Tfh病毒庫及生發(fā)中心B細(xì)胞功能調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。而由于組織獲取的方法有限，本研究僅限于HIV感染者外周血CXCR5+CD8+T細(xì)胞，因而不能很好地解釋人體組織內(nèi)的該群細(xì)胞免疫特點(diǎn)及其在HIV感染組中與健康對照組的差異。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)HIV慢性感染者外周血CXCR5+CD8+T細(xì)胞頻率和功能與疾病進(jìn)展密切相關(guān)。提示該群細(xì)胞在HIV感染免疫致病中可能發(fā)揮了重要作用，為HIV感染免疫致病機(jī)制提供了新的解釋。一方面，CXCR5+CD8+T細(xì)胞可能發(fā)揮了重要的抗病毒作用，另一方面其免疫負(fù)調(diào)控作用可能也損傷了HIV感染者生發(fā)中心的B細(xì)胞應(yīng)答。通過進(jìn)一步的深入研究，可能揭示HIV感染中CXCR5+CD8+T細(xì)胞、Tfh及生發(fā)中心B細(xì)胞的相互作用機(jī)制，并為HIV感染病毒庫的清除及HIV疫苗的研制提供新的可能的方向。

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