HBsAg/HBsAb雙陽(yáng)性慢性乙型肝炎患者HBV S基因免疫逃逸相關(guān)變異分析

唐子淋，劉 妍，劉佳梁，思蘭蘭，李 樂(lè)，廖 昊，邵金曼，徐東平，李 進(jìn)

HBV感染是一種全球傳染性疾病，WHO 2017年最新發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示在全球范圍內(nèi)約2.57億人有慢性HBV感染[1]。HBsAg是用于診斷HBV感染的重要標(biāo)志，而HBsAb是由HBsAg暴露的抗原決定簇刺激機(jī)體產(chǎn)生的特異性保護(hù)抗體，可以中和血清中的HBsAg。通常情況下HBsAb出現(xiàn)在HBsAg消失后或注射乙型肝炎（乙肝）疫苗后，是HBV感染終止和機(jī)體對(duì)HBV產(chǎn)生免疫力的標(biāo)志，但在臨床實(shí)際檢測(cè)中，也可見(jiàn)血清HBsAg和HBsAb同時(shí)陽(yáng)性的現(xiàn)象[2]。目前這種雙陽(yáng)性現(xiàn)象的臨床意義和發(fā)生機(jī)制尚未完全明確，可能與多種因素有關(guān)，其中HBV S基因變異引起的抗原性改變，可能與HBV感染慢性乙肝患者血清中HBsAg/HBsAb雙陽(yáng)性現(xiàn)象相關(guān)[3-4]。

HBV包膜蛋白由preS/S基因編碼，其中S基因主要親水區(qū)（major hydrophilic region,MHR）（aa 99～169）編碼暴露在病毒顆粒表面上的主要構(gòu)象表位，該區(qū)段發(fā)生的變異，包括替換、插入、缺失和提前終止都能影響 HBsAg 的表達(dá)、分泌和識(shí)別[5-6]。有研究表明如若變異使病毒基因在原有的s146-148NCT N-糖基化位點(diǎn)基礎(chǔ)上額外增加NXT/S（X不為P）位點(diǎn)，則會(huì)引入新增N-糖基化變異，可降低HBsAb與HBsAg的親和力，增加病毒分泌，從而引起免疫逃逸，可造成HBsAg/HBsAb雙陽(yáng)性[7]。本研究旨在明確HBsAg/HBsAb雙陽(yáng)性慢性乙肝患者HBV S基因MHR免疫逃逸相關(guān)變異特點(diǎn)，分析變異與雙陽(yáng)性的相關(guān)性。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 2007—2013年于解放軍第三〇二醫(yī)院就診且HBsAg與HBsAb同時(shí)呈陽(yáng)性的慢性乙肝患者。HBsAg/HBsAb雙陽(yáng)性組（雙陽(yáng)性組）納入標(biāo)準(zhǔn)：①間隔至少半年，連續(xù)2次以上檢測(cè)確認(rèn)HBsAg與HBsAb同時(shí)呈陽(yáng)性；②無(wú)HCV、HDV、HIV重疊感染；③腹部超聲、CT、MRI等影像學(xué)檢查或肝組織病理學(xué)檢查未提示肝硬化及原發(fā)性肝癌。最終共89例患者被納入雙陽(yáng)性組。同時(shí)根據(jù)以上第②及第③條標(biāo)準(zhǔn)隨機(jī)匹配納入148例HBsAg陽(yáng)性且HBsAb陰性的慢性乙肝患者作為HBsAg單陽(yáng)性組（單陽(yáng)性組）。慢性乙肝診斷均依據(jù)我國(guó)《慢性乙型肝炎防治指南（2010年）》[8]確立。本研究納入的237例患者均簽署相關(guān)知情同意書(shū)，并經(jīng)解放軍第三〇二醫(yī)院倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)。

1.2 試劑 病毒DNA提取試劑盒購(gòu)自于北京天恩澤生物技術(shù)有限公司；電泳marker（2000 bp）購(gòu)自于 TaKaRa大連寶生物工程有限公司；瓊脂糖以及2×EasyTaq PCR SuperMix均購(gòu)自于北京全式金生物技術(shù)有限公司；PCR產(chǎn)物回收純化試劑盒購(gòu)自于美國(guó)Qiagen公司；引物合成和基因測(cè)序工作由北京天一輝遠(yuǎn)生物技術(shù)有限公司完成。

1.3 方法

1.3.1 乙肝血清學(xué)標(biāo)志物及血清HBV DNA定量 乙肝血清學(xué)標(biāo)志物（HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb）及血清HBV DNA定量由解放軍第三〇二醫(yī)院臨床檢驗(yàn)中心檢測(cè)。乙肝血清學(xué)標(biāo)志物采用化學(xué)發(fā)光法定性檢測(cè)，HBV DNA定量采用羅氏公司商品試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，其檢測(cè)下限為100 IU/ml。

1.3.2 巢式PCR擴(kuò)增HBV S基因并測(cè)序 從解放軍第三〇二醫(yī)院血清樣本庫(kù)中提取2組患者血清樣本。采用病毒提取試劑盒提取2組患者血清HBV DNA，使用本課題組自主研發(fā)的一管式巢式PCR法擴(kuò)增HBV S基因技術(shù)（國(guó)家發(fā)明專(zhuān)利ZL 200910092331.1，病毒載量的擴(kuò)增下限為20 IU/ml），PCR產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳鑒定并行基因測(cè)序。

1.3.3 HBV基因型與HBV S基因免疫逃逸相關(guān)變異與新增N-糖基化變異分析 使用DNASTAR軟件中的SeqMan 7.1.0模塊進(jìn)行序列拼接。使用MEGA 4軟件對(duì)測(cè)序所得HBV DNA序列進(jìn)行基因型分型，使用DNASTAR Lasergene MegAlign軟件進(jìn)行變異比對(duì)分析。應(yīng)用GenBank中標(biāo)準(zhǔn)參考序列進(jìn)行比較，標(biāo)準(zhǔn)參考序列從在線肝炎病毒數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genotyping/formpage.cgi）獲得。本研究重點(diǎn)分析既往研究中報(bào)道過(guò)的HBV S基因MHR免疫逃逸相關(guān)變異（表1）[9-13]。

表1 既往研究報(bào)道的HBV S基因MHR免疫逃逸相關(guān)變異Table 1 Immune escape related mutations within MHR of HBV S gene in previous reports

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用Excel 2007軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，使用IBM SPSS 21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。本研究采用的巢式PCR方法擴(kuò)增HBV S基因的專(zhuān)利技術(shù)檢測(cè)下限約為20 IU/ml，而HBV DNA臨床檢驗(yàn)科檢測(cè)下限為100 IU/ml，故低于臨床檢測(cè)下限的樣本HBV DNA按照中間值60 IU/ml計(jì)算，即1.78 log10IU/ml。變異率比較采用四格表χ2檢驗(yàn)，2組間非正態(tài)分布的連續(xù)性數(shù)據(jù)比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 2組慢性乙肝患者基本臨床資料 本研究最終納入的患者均為C基因型HBV感染。2組患者一般臨床情況如下：雙陽(yáng)性組患者年齡最小為1歲，最大為61歲，中位數(shù)為39.0歲，其中男性65例（73.03%），女性24例（26.97%）。單陽(yáng)性組患者年齡最小為2歲，最大為89歲，中位數(shù)為40.5歲，其中男性128例（86.49%），女性20例（13.51%）。2組患者在ALT、TBIL、HBV DNA載量、HBeAg陽(yáng)性率方面差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2）。

表2 2組患者一般臨床資料Table 2 General clinical data of patients in 2 groups

2.2 2組患者HBV S基因MHR免疫逃逸相關(guān)位點(diǎn)變異分析 雙陽(yáng)性組HBV S基因MHR免疫逃逸相關(guān)變異檢出率（31.46%，28/89）顯著高于單陽(yáng)性組（18.92%，28/148）（χ2=4.845，P=0.028）。單陽(yáng)性組在46個(gè)免疫逃逸相關(guān)位點(diǎn)中有15個(gè)位點(diǎn)發(fā)生了變異；而雙陽(yáng)性組中46個(gè)免疫逃逸相關(guān)位點(diǎn)有18個(gè)位點(diǎn)發(fā)生了變異，其中sL110I/S（12.36%，11/89）、sT113N/S（12.36%，11/89）、sT131I/N/P（8.99%，8/89）和sS143L/M/T（10.11%，9/89）4個(gè)單位點(diǎn)變異檢出率明顯高于單陽(yáng)性組（圖1）。

圖1 2組患者HBV S基因MHR免疫逃逸突變情況注：兩組比較，sL110I/S變異χ2=8.742，P=0.003； sT113N/S變異 χ2=10.954，P=0.001；sT131I/N/P變 異 χ2=4.615，P=0.032；sS143L/M/T變異χ2=5.970，P=0.015；*.P＜0.05Figure 1 Mutation of immune escape at HBV S gene MHR of patients in 2 groups

多位點(diǎn)聯(lián)合變異檢出率在雙陽(yáng)性組（20.22%，18/89）顯著高于單陽(yáng)性組（6.08%，9/148）（χ2=11.014，P=0.001），多位點(diǎn)聯(lián)合變異形式見(jiàn)表3。雙陽(yáng)性組以3聯(lián)變異形式為主，且存在3例4聯(lián)多位點(diǎn)聯(lián)合變異，2例6聯(lián)多位點(diǎn)聯(lián)合變異，其中sL110I+sT113S+sS143T變異形式最多，共7例（38.89%，7/18），而在單陽(yáng)性組中未發(fā)現(xiàn)這種多位點(diǎn)變異形式。單陽(yáng)性組則以2聯(lián)為主，僅有2例出現(xiàn)3聯(lián)多位點(diǎn)聯(lián)合變異。

2.3 2組患者新增N-糖基化變異分析 雙陽(yáng)性組患者中有7例在HBV S基因的MHR內(nèi)檢出新增N-糖基化變異（7.87%，7/89），其中5例患 者 檢 出 sT131N+M133T→s131-133NST，1例患者檢出sT116N→s116-118NST，1例患者檢出sT131N+M133T→s131-133NST合并sT116N→s116-118NST，其中sT131N+M133T→s131-133NST檢出率最高（71.43%，5/7）。而單陽(yáng)性患者僅3例檢出HBV S基因MHR新增N-糖基化變異（2.03%，3/148），2例 sT131N+M133T→s131-133NST，1例sQ129N→s129-131NGT。2組患者新增N-糖基化變異檢出率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.687，P=0.030）（表 4）。

3 討 論

HBV感染可以引起急、慢性病毒性肝炎，肝纖維化，更與肝細(xì)胞癌的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。乙肝血清五項(xiàng)是臨床中常用的診斷HBV感染的指標(biāo)。其中HBsAg與HBsAb的血清學(xué)轉(zhuǎn)換更是判斷患者病毒是否完全清除，是否能夠停止服用抗HBV藥物的重要參考依據(jù)。通常HBsAg與HBsAb不會(huì)同時(shí)處于陽(yáng)性狀態(tài)，但自1976年以來(lái)，血清HBsAg和HBsAb同時(shí)陽(yáng)性的現(xiàn)象屢有報(bào)道[5，14]。目前認(rèn)為關(guān)于HBsAg與HBsAb共存機(jī)制主要與HBV S基因免疫逃逸變異相關(guān)。HBV S基因編碼HBsAg，其MHR內(nèi)（尤其是α決定簇）的氨基酸變異可使HBsAg的抗原性發(fā)生改變，使HBsAg無(wú)法與HBsAb中和，可造成HBsAg/HBsAb雙陽(yáng)性[5，14-15]，此外HBV S基因MHR新增N-糖基化位點(diǎn)變異亦可降低HBsAg對(duì)HBsAb的親和力，從而造成HBsAg/HBsAb雙陽(yáng)性現(xiàn)象[7]。

表3 2組患者多位點(diǎn)聯(lián)合變異分析Table 3 Analysis of multiple mutation of immune escape at MHR of patients in 2 groups

表4 2組患者M(jìn)HR新增N-糖基化位點(diǎn)變異分析Table 4 Analysis of additional N-glycosylation mutations at MHR of patients in 2 groups

本研究共納入89例雙陽(yáng)性與148例單陽(yáng)性慢性乙肝患者。為了消除HBV基因型不同而對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生的影響，本研究將實(shí)驗(yàn)對(duì)象限定為HBV C基因型感染。2組患者的年齡、ALT、TBIL、HBV DNA載量、HBeAg陽(yáng)性率臨床指標(biāo)均未見(jiàn)顯著差異。在經(jīng)過(guò)對(duì)2組患者HBV S基因測(cè)序結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)雙陽(yáng)性組患者免疫逃逸相關(guān)位點(diǎn)累計(jì)變異率明顯高于單陽(yáng)性組，其中sL110I/S、sT113N/S、sT131I/N/P和sS143L/M/T的變異檢出率均顯著高于單陽(yáng)性組。雙陽(yáng)性組患者多位點(diǎn)聯(lián)合變異率亦顯著高于單陽(yáng)性組，且變異形式更復(fù)雜，以3聯(lián)多位點(diǎn)變異形式sL110I+sT113S+sS143T為主（38.89%，7/18），而這種多位點(diǎn)變異形式未發(fā)生在單陽(yáng)性組中。單陽(yáng)性組以2聯(lián)多位點(diǎn)變異形式為主。

此外，HBV S基因的MHR（aa 99～169）發(fā)生替換、插入、缺失等變異可能會(huì)引入新增N-糖基化變異，引起抗原性改變。在本研究中，雙陽(yáng)性組新增N-糖基化變異率亦顯著高于單陽(yáng)性組，雙陽(yáng)性組sT131N+M133T→s131-133NST檢出率最高，為71.43%。此外，有研究表明與野生型 HBsAg 相比，新增 N-糖基化變異的HBsAg/HBsAb 結(jié)合力減弱，在表型分析中發(fā)現(xiàn)比野生型HBsAg具有更好的病毒包膜形成和分泌能力，因此推測(cè)HBV S 基因新增 N-糖基化變異可能在HBsAg/HBsAb 雙陽(yáng)性共存狀態(tài)中發(fā)揮重要作用[16]。

本研究發(fā)現(xiàn)2組患者男女比例有差異（P=0.010），因此進(jìn)一步分析了2組發(fā)生變異男女患者比例，雙陽(yáng)性組28例發(fā)生變異的患者中有20例男性（71.43%）；單陽(yáng)性組28例發(fā)生變異的患者中有24例男性（85.71%）；2組發(fā)生變異的患者男女比例差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.193）。推測(cè)2組總體樣本的性別差異可能與患者的選擇和抽樣誤差有關(guān)。本研究為臨床真實(shí)世界的橫斷面研究，缺乏動(dòng)態(tài)的樣本信息，但樣本量較為充足，有一定的臨床意義。

總之，與HBsAg單陽(yáng)性患者相比，HBsAg/HBsAb雙陽(yáng)性患者中HBV S基因可檢出更多變異種類(lèi)、更高變異檢出率、更多聯(lián)合變異復(fù)雜形式的MHR免疫逃逸相關(guān)變異，并且新增N-糖基化變異檢出率也更高，這些變異可能是引起HBsAg/HBsAb雙陽(yáng)性共存的驅(qū)動(dòng)因素之一。本課題組之前的研究發(fā)現(xiàn)HBV S基因MHR區(qū)新增N-糖基化變異是HBsAg/HBsAb雙陽(yáng)性患者進(jìn)展為肝癌的主要風(fēng)險(xiǎn)因素[17]，因此應(yīng)關(guān)注并定期監(jiān)測(cè)雙陽(yáng)性慢性乙肝患者的HBV S基因變異與病情進(jìn)展。

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