過(guò)氧乙酸戊二醛復(fù)方消毒劑對(duì)羊舍環(huán)境真菌的消毒效果評(píng)價(jià)

郭 耀，張艷冰，高曉莎，段晉偉，鄭明學(xué)，霍乃蕊，劉興國(guó)，古少鵬

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西太谷 030801；2.中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，北京 100125）

環(huán)境消毒對(duì)控制動(dòng)物疫病的發(fā)生和傳播具有重要作用。常用的消毒劑有鹵素類(lèi)、醛類(lèi)、酚類(lèi)、醇類(lèi)、氧化劑類(lèi)、表面活性劑類(lèi)和酸堿類(lèi)等。各類(lèi)消毒劑作用機(jī)制不同，也都存在各自的缺陷，因而制約了其在生產(chǎn)中的應(yīng)用[1-3]。過(guò)氧乙酸戊二醛復(fù)方消毒劑（專(zhuān)利號(hào)：ZL 2009 1 0263970.x）是山西農(nóng)業(yè)大學(xué)研制的高效廣譜消毒劑，能殺滅多種細(xì)菌芽孢及病毒，具有迅速、高效、長(zhǎng)效和抗干擾能力強(qiáng)的特點(diǎn)[4-5]。目前尚未對(duì)該消毒劑對(duì)真菌的殺滅作用進(jìn)行系統(tǒng)研究。動(dòng)物養(yǎng)殖環(huán)境中的大量真菌及孢子，通過(guò)氣溶膠經(jīng)呼吸道或傷口進(jìn)入人和動(dòng)物體內(nèi)，引起各種疾病，因而環(huán)境消毒可有效遏制真菌性疾病的傳播和發(fā)生[6-7]。為探究該復(fù)方消毒劑對(duì)環(huán)境真菌的消毒效果，本研究依據(jù)《消毒與滅菌效果的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)》和《消毒技術(shù)規(guī)范（2002年版）》，以羊舍環(huán)境氣載真菌優(yōu)勢(shì)菌黑曲霉和青霉及白色念珠菌為指示菌，測(cè)定了復(fù)方消毒劑、新潔爾滅、癸甲溴銨、聚維酮碘和過(guò)氧乙酸5種消毒劑對(duì)真菌的殺滅效果，并進(jìn)行了羊舍現(xiàn)場(chǎng)消毒試驗(yàn)，以期為該消毒劑的推廣應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 菌株

黑曲霉、青霉，羊舍環(huán)境氣載優(yōu)勢(shì)真菌：本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定；白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株（ATCC10231）：晉中市第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科惠贈(zèng)。

1.2 試劑與儀器

新潔爾滅：山東名德醫(yī)療科技公司生產(chǎn)（27～33 g/L）；癸甲溴銨溶液：上海派斯德生化公司生產(chǎn)（10 g，100 mL）；聚維酮碘溶液：山東正邦生物科技公司生產(chǎn)（5%）；過(guò)氧乙酸：天津永大化學(xué)試劑公司（15%～18%）；過(guò)氧乙酸戊二醛復(fù)方消毒劑（過(guò)氧乙酸含量4%）：本實(shí)驗(yàn)室制備；Andersen-6級(jí)撞擊式空氣微生物采樣器（TE-10-800）：美國(guó)TEI公司；中和劑以及真菌培養(yǎng)基等。

2 方法

2.1 殺滅效果比較

2.1.1 菌懸液的制備 參照《消毒技術(shù)規(guī)范（2002年版）》，將黑曲霉、青霉和白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株接種沙氏斜面培養(yǎng)基，27 ℃恒溫培養(yǎng)3～5 d，洗下菌苔，振蕩分散，稀釋成含菌量為1×108～5×108cfu/mL 的菌懸液。

2.1.2 消毒劑的配制 根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明推薦的使用濃度范圍（依據(jù)課題組前期試驗(yàn)結(jié)果，過(guò)氧乙酸戊二醛復(fù)方消毒劑以1∶256稀釋作為推薦使用濃度），用滅菌硬水將5種消毒劑稀釋?zhuān)⊥扑]使用濃度的最低、中間和最高濃度值（表1）。

表1 5種消毒劑的稀釋濃度與有效成分含量

2.1.3 中和劑鑒定試驗(yàn) 以白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株為試驗(yàn)菌，參照《消毒技術(shù)規(guī)范（2002年版）》，按懸液定量殺菌試驗(yàn)程序進(jìn)行中和劑鑒定試驗(yàn)及結(jié)果評(píng)判。

2.1.4 懸液定性、定量殺滅試驗(yàn) 參照《消毒與滅菌效果的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)》和《消毒技術(shù)規(guī)范（2002年版）》，用滅菌生理鹽水制備白色念珠菌、黑曲霉和青霉菌懸液。將菌懸液與配制好的消毒劑分別作用10 min、30 min、2 h、6 h和24 h后，加入到對(duì)應(yīng)的中和劑中，振蕩混勻。吸取與中和劑混勻后的液體0.1 mL，用生理鹽水做梯度稀釋?zhuān)坎嫉今R鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，27 ℃或37 ℃（白色念珠菌）恒溫培養(yǎng)3 d后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，同時(shí)設(shè)菌懸液對(duì)照組，重復(fù)5次試驗(yàn)。

結(jié)果判定如下：殺滅對(duì)數(shù)值（KL）= lgX-lgX0；X為對(duì)照組平均活菌濃度（cfu/mL）；X0為試驗(yàn)組平均活菌濃度（cfu/mL）。當(dāng)殺滅對(duì)數(shù)值KL＞3時(shí)，消毒合格；當(dāng)KL＞5時(shí)，消毒劑殺菌效果良好。

2.2 羊舍環(huán)境消毒試驗(yàn)

2.2.1 消毒場(chǎng)地 選擇半封閉羊舍3棟。羊舍及飼養(yǎng)情況見(jiàn)表2。

表2 羊舍參數(shù)及飼養(yǎng)情況

2.2.2 消毒方法 過(guò)氧乙酸戊二醛復(fù)方消毒劑稀釋濃度1∶256，按照20 mL/m3劑量對(duì)羊舍進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)噴霧消毒。消毒前先對(duì)羊舍環(huán)境做濕潤(rùn)處理，使其濕度達(dá)到60%～80%，消毒噴霧機(jī)加裝霧化噴頭。

2.2.3 羊舍氣載真菌的消毒效果監(jiān)測(cè) 消毒前以及消毒后30 min、6 h和24 h，分別用Andersen-6級(jí)撞擊式空氣微生物采樣器采集氣載真菌。采樣介質(zhì)為琥紅氯霉素培養(yǎng)基；采樣高度50～80 cm、流量28.3 L/min，驅(qū)動(dòng)時(shí)間3 min。27 ℃恒溫培養(yǎng)48～72 h后計(jì)數(shù)。

2.2.4 對(duì)羊舍表面載體消毒效果監(jiān)測(cè)

采樣情況同2.2.1。用無(wú)菌棉拭子對(duì)羊舍內(nèi)的墻壁、地面及籠具上分別取點(diǎn)擦拭，消毒前后采樣點(diǎn)相鄰但不重復(fù)，涂擦面積為5 cm×5 cm；將棉拭子放入10 mL滅菌洗脫液中［0.5%（吐溫-80）+1%卵磷脂+1%甘氨酸+0.5%硫代硫酸鈉］進(jìn)行洗脫處理，然后接種琥紅氯霉素培養(yǎng)基培養(yǎng)計(jì)數(shù)。

2.2.5 平均殺菌率計(jì)算 平均殺菌率=（消毒前平均真菌總數(shù)-消毒后平均真菌總數(shù)）/消毒前平均真菌總數(shù)×100%。

3 結(jié)果

3.1 中和劑鑒定試驗(yàn)

結(jié)果顯示中和劑可有效中和對(duì)應(yīng)消毒液對(duì)試驗(yàn)菌株的殘留作用（表3）。

表3 中和劑的配置

3.2 懸液定性、定量殺滅試驗(yàn)

3.2.1 白色念珠菌 按癸甲溴銨與過(guò)氧乙酸最低推薦使用濃度作用10 min，即可達(dá)到消毒合格標(biāo)準(zhǔn)；新潔爾滅和聚維酮碘則需要用最高推薦使用濃度，方可殺滅白色念珠菌；而復(fù)方消毒劑1∶512稀釋或1∶256作用10 min，可達(dá)到消毒合格（表4）。

表4 消毒劑定量殺滅白色念珠菌效果

3.2.2 黑曲霉孢子 聚維酮碘、癸甲溴銨與過(guò)氧乙酸對(duì)黑曲霉孢子的殺滅效能相近，新潔爾滅對(duì)黑曲霉孢子的殺滅效果不佳，而復(fù)方消毒劑1∶512稀釋?zhuān)饔?0 min，即可完全殺滅黑曲霉孢子（表5）。

3.2.3 青霉孢子 聚維酮碘與過(guò)氧乙酸按最低推薦使用濃度作用10 min，即可達(dá)到對(duì)青霉孢子消毒合格；癸甲溴銨需要按推薦中劑量濃度作用30 min或最高推薦濃度作用10 min，才可達(dá)到消毒合格；而復(fù)方消毒劑1∶512稀釋作用30 min或1∶256作用10 min，即可達(dá)到消毒合格（表6）。

表5 消毒劑定量殺滅黑曲霉孢子效果

表6 消毒劑定量殺滅青霉孢子效果

3.3 羊舍環(huán)境消毒試驗(yàn)

3.3.1 氣載真菌消毒效果 參考實(shí)驗(yàn)室消毒結(jié)果，復(fù)方消毒劑在1∶256倍稀釋濃度下對(duì)指示真菌和試驗(yàn)菌均有良好的殺滅作用，用過(guò)氧乙酸戊二醛復(fù)方消毒劑以1∶256稀釋?zhuān)?0 mL/m3劑量，對(duì)羊舍進(jìn)行噴霧消毒，30 min后舍內(nèi)氣載真菌濃度開(kāi)始下降，6 h后氣載真菌殺滅率分別達(dá)到47.8%、61.1%和68.1%，并可持續(xù)24 h以上（圖1、表7）。

3.3.2 表面載體消毒效果 表面載體消毒后30 min即達(dá)到最佳消毒效果，地面、墻壁和籠具的殺滅率分別為89.3%、72.3%和88.7%，并可維持24 h以上（圖2）。

4 分析與討論

圖1 半封閉式羊舍消毒前后氣載真菌濃度變化

表7 半封閉式羊舍環(huán)境指標(biāo)

圖2 半封閉式羊舍消毒前后表面載體真菌濃度變化

新潔爾滅為低效消毒劑。本試驗(yàn)中新潔爾滅對(duì)真菌的殺滅效果均不理想，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[10]。聚維酮碘雖表現(xiàn)出良好的殺菌效果，但其推薦的使用濃度接近原液，使用高濃度的聚維酮碘用可能會(huì)對(duì)皮膚造成損傷[8]，且成本過(guò)高。癸甲溴銨的推薦低劑量即可完全殺滅白色念珠菌，對(duì)黑曲霉和青霉則需要中、高劑量才可有效殺滅。

本試驗(yàn)中，過(guò)氧乙酸與復(fù)方消毒劑的低劑量均可有效殺滅真菌，但復(fù)方消毒劑中的過(guò)氧乙酸僅占4%左右，達(dá)到相同消毒效果所需有效成分濃度更低。由于過(guò)氧乙酸穩(wěn)定性較差，對(duì)人體具有刺激性和毒性，對(duì)物品具有腐蝕性，因而限制了其使用[9-10]。本實(shí)驗(yàn)室研制的復(fù)方消毒劑，一方面降低了過(guò)氧乙酸的使用濃度，從而減小毒性，另一方面通過(guò)各成分之間的協(xié)同作用，增加了其穩(wěn)定性和抗干擾性。

各單組分消毒劑對(duì)不同菌株的敏感性不盡相同，尤其是黑曲霉對(duì)季銨鹽類(lèi)和鹵素類(lèi)消毒劑的耐受性較強(qiáng)，但對(duì)氧化型及復(fù)方消毒劑較為敏感；聚維酮碘對(duì)青霉孢子殺滅效果較好，但對(duì)黑曲霉和念珠菌則不夠穩(wěn)定；而復(fù)方消毒劑對(duì)3種真菌的殺滅效果均比較穩(wěn)定，1∶256稀釋?zhuān)饔?0 min即可完全殺滅，可見(jiàn)消毒劑之間的配伍有益于其抗菌譜和抗干擾能力的增加。

常見(jiàn)的復(fù)方消毒劑由消毒劑、增效劑、穩(wěn)定劑、表面活性劑和緩蝕劑等成分組成。研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)氧乙酸與二氯二甲基海因配伍，可對(duì)枯草桿菌芽孢具有快速高效的殺滅作用，戊二醛與季銨鹽類(lèi)消毒劑配伍后，抗干擾能力增強(qiáng)，過(guò)氧化氫和許多理化因子都有協(xié)同增效的作用[11-14]。

復(fù)方消毒劑在現(xiàn)場(chǎng)消毒試驗(yàn)中，對(duì)氣載真菌的殺滅率為47.1%～68%，且可持續(xù)24 h以上，與文獻(xiàn)報(bào)道相同[15]。但與密閉空間的消毒效果差距較大。這與生產(chǎn)實(shí)踐中消毒場(chǎng)所無(wú)法密閉有關(guān)，且羊舍屋頂裝有無(wú)動(dòng)力風(fēng)機(jī)，舍內(nèi)外隨時(shí)進(jìn)行氣體交換。這提示生產(chǎn)應(yīng)用中應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況適當(dāng)加大使用濃度和劑量[16]，或者密封圈舍。羊舍消毒10 min后，舍內(nèi)氣載真菌濃度不降反升，可能是噴灑過(guò)程中將地面墻壁等表面附著沉積的真菌粒子懸浮到于空氣中導(dǎo)致的。本試驗(yàn)為帶羊消毒，過(guò)程中羊群未出現(xiàn)明顯的咳嗽、流淚、流涕等表觀現(xiàn)象，但相關(guān)毒理試驗(yàn)尚需要作出系統(tǒng)評(píng)價(jià)。本研究只獲得了初步評(píng)價(jià)結(jié)果，應(yīng)進(jìn)一步對(duì)其殺菌譜、使用安全性等進(jìn)行全方位評(píng)估。

5 結(jié)論

過(guò)氧乙酸戊二醛復(fù)方消毒劑在實(shí)驗(yàn)室消毒和現(xiàn)場(chǎng)消毒試驗(yàn)中1∶256稀釋作用10 min即可高效殺滅真菌孢子，比市售常見(jiàn)消毒劑所需有效成分濃度更低，用時(shí)更短。

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