牛傳染性鼻氣管炎病毒LAMP檢測方法的建立

高 峰，王建峰，于伯華，張 丹，劉向陽，張 琳，秦志軍，唐泰山

（1. 鹽城出入境檢驗檢疫局，江蘇鹽城 224002；2. 寧波檢驗檢疫科學技術研究院，浙江寧波 315100；3. 江蘇出入境檢驗檢疫局，江蘇南京 210001）

牛傳染性鼻氣管炎（IBR）是由牛傳染性鼻氣管炎病毒（IBRV）引起牛的一種急性、熱性、接觸性傳染病，以鼻氣管炎、眼結膜炎、高熱、流產、傳染性膿皰性外陰道炎為主要特征[1]，為世界動物衛(wèi)生組織（OIE）法定報告動物疫病。IBRV可通過空氣、媒介物，以及與病牛直接接觸傳播，20～60日齡犢牛對其最易感，對6周齡以下犢牛的病死率可達85%～100%[2]。目前針對IBR的病原學檢測有包涵體檢查、病毒分離、PCR、qPCR和熒光定量PCR等[3]；血清學診斷方法有中和試驗、瓊脂擴散試驗、間接血凝試驗、ELISA試驗和變態(tài)試驗等[4]。但這些方法不是操作繁瑣，就是需要高昂的設備和試劑。環(huán)介導等溫擴增（Loop-mediated isothermal ampli fi cation，LAMP）是一種新型的核酸等溫擴增技術，最早由日本 Notomi 等[5]報道，具有條件簡單、操作方便等突出優(yōu)點，是近年來發(fā)展起來的一種快速臨床疾病診斷方法[6]。與其它分子生物學方法相比，LAMP 具有方便、簡捷、靈敏等優(yōu)點。本研究以IBRV為研究對象，基于LAMP技術，建立了可視化LAMP檢測方法，有效縮短了檢測時間，加快了通關速度，便于口岸、基層等特殊場所動物疫病檢測的開展。

1 材料與方法

1.1 病毒株

牛傳染性鼻氣管炎病毒（IBRV）、藍舌病病毒、赤羽病病毒、牛病毒性腹瀉病毒、牛白血病病毒、小反芻獸疫病毒和偽狂犬病病毒，由江蘇出入境檢驗檢疫局動檢實驗室提供。

1.2 主要試劑、儀器及耗材

病毒株病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒（貨號DP315）、 DNA純化回收試劑盒（貨號DP214-02）：購自天根生化科技（北京）有限公司；反轉錄試劑盒（D2680A）：購自TaKaRa公司。其他：甜菜堿（Sigma 公司）、Bst DNA大片段擴增酶（NEB公司）、SYBR Green I（Invitrigen 公司）

1.3 LAMP引物設計及合成

根據GenBank中發(fā)表的IBRV全基因序列，利用MEGA 3.1進行同源性比對；選擇基因中的高保守區(qū)域，采用Primer explorer V4網上在線軟件（http∶//primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html） 設計3對針對靶基因的引物，包括2條外引物F3和B3、2條內引物FIP和BIP，以及引物LF和LB。引物序列如表1所示。

表1 RT-LAMP引物序列

1.4 病毒核酸提取及反轉錄

RNA和DNA病毒核酸的提取，參照病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒說明書進行。其中對RNA，再利用反轉錄試劑盒，將RNA反轉錄為cDNA，-20 ℃ 保存。

1.5 LAMP檢測體系優(yōu)化

在LAMP基本反應體系基礎上設置不同內引物濃度（0.2、0.4、0.8、1.6、2.0、2.4 μmol/L），dNTP 濃度（0、0.2、0.4、0.8、1.0、1.2、1.4、2.0和2.4 mmol/L），Mg2+濃度（2、4、6、8、10和12 mmol/L）和反應溫度（45、50、55、57、60、63、65、67和70 ℃），然后分別進行單因素實驗，探索各因素對LAMP的影響，獲得最佳反應參數。

1.6 LAMP 靈敏性試驗

提取IBRV核酸，按照107～100copies/μL進行10倍比梯度稀釋；以此為模板分別進行LAMP擴增，分析檢測體系的靈敏度。

1.7 LAMP 特異性試驗

提取IBRV、藍舌病病毒、赤羽病病毒、牛病毒性腹瀉病毒、牛白血病病毒、小反芻獸疫病毒和偽狂犬病病毒核酸，并以此為模板進行LAMP擴增，分析檢測體系的特異性。

1.8 LAMP 反應時間

分別反應 5、10、15、20、25、30、40、50和60 min，評估反應時間。

2 結果與分析

2.1 內引物濃度梯度試驗

分別用 0.2、0.4、0.8、1.6、2.0、2.4 μmol/L 引物進行內引物濃度優(yōu)化，發(fā)現最佳引物濃度為2.4μmol/L。其中，黃綠色為陽性結果，淺橙色為陰性結果（圖1）。

圖1 內引物優(yōu)化結果

2.2 dNTP濃度梯度試驗

分 別 用 0、0.2、0.4、0.8、1.0、1.2和 1.4 mmol/L dNTP濃度進行試驗摸索，發(fā)現最佳dNTPs濃度為1.0 mmol/L。其中，黃綠色為陽性結果，淺橙色為陰性結果（圖2）。

圖2 dNTP優(yōu)化結果

2.3 Mg2+ 濃度梯度試驗

分別用 2、4、6、8、10、12 μmol/L 濃度進行試驗摸索，發(fā)現Mg2+最佳濃度濃度為8 μmol/L。其中，黃綠色為陽性結果，淺橙色為陰性結果（圖3）。

圖3 Mg2+優(yōu)化結果

2.4 溫度梯度試驗

分別采用 67、65、63 、60、57、55、50、45 ℃進行試驗摸索，發(fā)現佳反應溫度為65 ℃。其中，黃綠色為陽性結果，淺橙色為陰性結果（圖4）。

圖4 溫度優(yōu)化結果

2.5 LAMP特異性試驗

特異性試驗結果顯示，藍舌病病毒、赤羽病病毒、牛病毒性腹瀉病毒等6種其他病原全為陰性，僅IBRV為陽性，說明所建立的LAMP技術特異性較好（圖5）。

圖5 特異性實驗結果

2.6 LAMP靈敏度試驗

分別采用不同核酸濃度106、105、104、103、102、101copies/μL進行試驗摸索，最終確定IBRV靈敏度為103copies/μL。其中，黃綠色為陽性結果，淺橙色為陰性結果（圖6）。

圖6 靈敏度結果

3 討論

IBR是由牛皰疹病毒I型引起的一種急性、熱性、接觸性傳染病。此病在全球范圍內廣泛分布，主要損害牛的呼吸系統(tǒng)及生殖系統(tǒng)，給養(yǎng)牛業(yè)帶來巨大經濟損失[8]。目前，我國口岸動物檢疫部門已明確規(guī)定凡是進境的牛及其制品必須檢測IBRV。近年來，我國進境種（奶）用牛數量和種類不斷增加，待檢疫病種類較多，在實際檢驗檢疫工作中，每進口一批活動物，往往要做上萬次檢測，因而需要花費大量時間和試劑，以及復雜的人工操作。因此，必須尋找一種高通量、高靈敏度、省時省力、經濟且操作簡單的檢測方法，以加速口岸通關速度，提高口岸檢測水平，并能有效防控外來動物疫病入侵。

可視化的逆轉錄環(huán)介導等溫擴增（LAMP）方法相比其他方法，具有快速、高效、高敏感及高特異的特點[9]。馮蒙等[10]也建立了IBRV LAMP 方法。該法可在50 min內檢出標準陽性質粒，且不發(fā)生交叉反應，通過肉眼直接觀察即可判斷結果。本研究以IBRV核酸作為研究對象，尋找該病毒的特異性保守基因序列，利用LAMP在線軟件，設計篩選出特異性引物，利用具有鏈置換作用的Bst DNA聚合酶進行靶序列的識別和延伸，對待測靶序列進行超指數擴增，以驗證引物的特異性和敏感性。在LAMP基本反應體系基礎上，設置不同內引物濃度（0.2、0.4、0.8、1.6、2.0、2.4 μmol/L），dNTP 濃 度（0、0.2、0.4、0.8、1.0、1.2、1.4、2.0、2.4 mmol/L），Mg2+濃度（2、4、6、8、10、12 mmol/L）和反應溫度（45、50、55、57、60、63、65、67 ℃）分別進行試驗，探索各因素對LAMP的影響，以獲得最佳反應參數，最終建立了靈敏度高的IBRV LAMP檢測方法，靈敏度可達到103拷貝/μL。本研究對牛白血病病毒等6種牛主要疫病病原進行特異性分析，結果僅IBRV為陽性，特異性良好。本研究在反應體系中添加了堿土金屬離子指示劑羥基萘酚藍（HNB）。由于反應副產物焦磷酸根離子和反應體系中的Mg2+生成焦磷酸鎂沉淀，不斷消耗游離Mg2+，導致反應前后顏色顯著改變，從而使IBRV檢測可視化。

4 結論

本研究建立的可視化IBRV LAMP檢測方法具有特異性和敏感性高、操作簡便、耗時短等特點，適用于口岸進出口動物的IBR快速檢疫。

參考文獻：

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[10] 馮蒙. 可視化檢測牛傳染性鼻氣管炎病毒LAMP法的建立及其對流行狀況的初步調查[D]. 南京：南京農業(yè)大學，2014.