豬偽狂犬病病毒gE蛋白間接ELISA抗體檢測方法的建立

寇曉晶，高 峰，郭慧琳，劉劍鋒

（1.甘肅省動物疫病預(yù)防控制中心，甘肅蘭州 730000；2. 鹽城出入境檢驗檢疫局，江蘇鹽城 224002；3. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，江蘇南京 210014）

偽狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）是一種皰疹病毒，能夠感染豬、牛、羊等家畜及野生動物，主要侵害神經(jīng)系統(tǒng)及生殖系統(tǒng)，降低家畜的生產(chǎn)性能，甚至導(dǎo)致動物死亡。據(jù)不完全統(tǒng)計，全世界范圍內(nèi)己有44個國家和地區(qū)報道過偽狂犬病的發(fā)生。

豬是PRV的天然宿主，各個階段豬均可感染。新生仔豬感染后呈現(xiàn)神經(jīng)癥狀，且死亡率極高；妊娠母豬、種公豬以繁殖障礙為主；生長育肥豬則表現(xiàn)為呼吸道癥狀[1-2]。一旦豬群發(fā)生PRV感染，病毒很難被清除。豬偽狂犬病因傳播速度快、范圍廣、途徑多，以及病原頑固等特點，被定義為極難防疫的自然疫源性疾病，國際動物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為須報告動物疫病。目前，一些歐洲和北美國家通過積極有效的疾病防控手段和撲殺程序，已將PRV徹底凈化。但PRV在我國仍廣泛流行，引起的經(jīng)濟(jì)損失巨大。

目前PRV的診斷方法主要有病毒分離培養(yǎng)、PCR、血清抗體檢測等[3-7]。但病毒分離培養(yǎng)耗時較長，一般需要耗時2～3 d，并且敏感性較差；PCR是一種快速、精確、敏感的檢測方法，但對專業(yè)技能要求較高，且設(shè)備昂貴，不適用于臨床推廣[8-9]。相比上述兩種檢測方法，血清抗體檢測具有操作簡單、敏感性好、能大批量檢測樣品的優(yōu)點，更能符合臨床檢測需要。

根據(jù)瘡疹病毒糖蛋白命名法，PRV的糖蛋白統(tǒng)一命名為gB、gC、gD、gE、gH、gJ、gK、gL、gM、gN，其中g(shù)E是主要的毒力因子。病毒在體外培養(yǎng)時，gE的缺失并不影響其增殖性能和免疫原性，但病毒毒力則會降低，從而為該病疫苗制備提供了思路[10]。目前，幾乎所有分離到的野毒株中都含有g(shù)E蛋白[11]。當(dāng)動物自然感染PRV時，血清中的gE抗體則會升高，而gE蛋白缺失疫苗免疫后則不會產(chǎn)生gE抗體。因此，選擇gE蛋白作為包被抗原，可用于豬群野毒感染的臨床檢測。

本研究以gE蛋白為包被抗原，建立了PRV野毒株ELISA檢測方法，并通過與國際知名產(chǎn)品進(jìn)行對比試驗和穩(wěn)定性試驗，確定該方法可用于豬偽狂犬病檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

PRV原核表達(dá)重組gE純化蛋白：由本公司合成、表達(dá)及純化；辣根過氧化物酶（HRP）羊抗豬：購自億米諾公司；TMB底物顯色液：本公司自備；胎牛血清：購自美國Gibco公司；96孔可拆式酶標(biāo)板、酶標(biāo)儀：購自美國Thermo公司；豬偽狂犬病毒gE蛋白抗體ELISA檢測試劑盒：購自于美國IDEXX。其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 gE蛋白間接ELISA的建立及優(yōu)化 對抗原包被量、抗原包被條件、封閉液成分、孵育溫度、樣品稀釋液，以及二抗稀釋液成分和稀釋度等進(jìn)行優(yōu)化，根據(jù)P/N值建立最佳條件。

1.2.2 gE蛋白間接ELISA反應(yīng)體系的確立 取酶標(biāo)板，將待檢血清作1∶50稀釋，取100 μL加至酶標(biāo)板中。同時設(shè)陰、陽性對照各2孔，各取陰陽性對照100 μL 加入孔中（不用稀釋）。輕輕振勻孔中樣品，蓋上蓋板膜，置室溫下溫育30 min。棄去孔中溶液，每孔加入稀釋好的洗滌液260 μL，靜置30 s后，棄去洗滌液；洗滌4次后在吸水紙上拍干。配制酶結(jié)合物工作液：按1∶100比例，混勻。每孔加酶結(jié)合物工作液100 μL，蓋上蓋板膜，室溫（25±2）℃下溫育30 min。棄去孔中溶液，洗滌4次后在吸水紙上拍干。將底物A液與底物B液按1∶1混合均勻，加入孔中（100 μL/孔），蓋上蓋板膜，室溫下反應(yīng)10 min。每孔加入終止液50 μL，5 min內(nèi)于OD450/630nm處測定結(jié)果。

1.2.3 gE蛋白間接ELISA陰陽性判定標(biāo)準(zhǔn)的建立 利用建立的方法，檢測陰陽性對照血清OD450/630nm差值，并各檢測20份陰陽性血清OD450/630nm差值，分別計算出陰陽性對照血清的平均OD值，以S/P值作為判定陰陽性標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.4 與國外標(biāo)桿產(chǎn)品的比對 用本自制產(chǎn)品與美國IDEXX公司產(chǎn)品，對246份豬血清分別進(jìn)行檢測，然后分析本自制產(chǎn)品的敏感性、特異性和符合率。

1.2.5 gE蛋白抗體檢測試劑盒穩(wěn)定性試驗 4 ℃條件下，用同一份血清檢測OD450/630nm差值以及陰陽性對照血清OD450/630nm差值。檢測時間分別為0 d、15 d、1個月、3個月、6個月及12個月。計算3批次的S/P值，探究試劑盒的有效期。

2 結(jié)果

2.1 gE蛋白間接ELISA陰陽性判定標(biāo)準(zhǔn)的建立

利用建立的PRV gE蛋白間接ELISA方法，檢測陰性對照血清、陽性對照血清、20份陰性血清和20份陽性血清的OD450/630nm差值。具體結(jié)果見表1。統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，陰性對照OD450/630nm平均差值為0.068，陽性對照為2.782。根據(jù)公式S/P=（樣本OD值-陰性對照平均值）/（陽性對照平均OD值-陰性對照平均值），以及陰陽性血清的檢測結(jié)果，初步確定S/P≥0.15為陽性，S/P＜0.15為陰性。

2.2 與美國IDEXX公司產(chǎn)品的比對

與美國IDEXX公司產(chǎn)品完成了246份臨床樣本的比對試驗，證明本自制的ELISA產(chǎn)品與該國外標(biāo)桿產(chǎn)品的陽性符合率為88.03%，陰性符合率為91.47%，總體符合率為89.84%（表2）。

表1 ELISA檢測豬血清結(jié)果（OD 450/630 nm差值）

表2 與國外進(jìn)口標(biāo)桿品牌符合度對比結(jié)果 單位：份

2.3 gE蛋白抗體檢測試劑盒的批間、批內(nèi)重復(fù)性

分別用3個批次組裝的試劑盒檢測5份血清的OD450/630nm差值，發(fā)現(xiàn)批間變異系數(shù)（CV）在3.44%～6.05%之間，均小于10%，表明PRV gE蛋白抗體檢測試劑盒不同批次間的重復(fù)性較好（表3）。

表3 批間重復(fù)性試驗結(jié)果

使用同批次組裝的試劑盒檢測與上相同的5份血清，根據(jù)OD450/630nm差值標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)，分析批內(nèi)重復(fù)性，發(fā)現(xiàn)批內(nèi)變異系數(shù)在2.14%～8.67%之間，均小于10%，表明PRV gE蛋白抗體檢測試劑盒同批次內(nèi)的重復(fù)性較好（表4）。

表4 批內(nèi)重復(fù)性試驗結(jié)果

2.4 gE蛋白抗體檢測試劑盒4℃保存試驗

4 ℃條件下，0 d、15 d、1個月、3個月、6個月和12個月的保存試驗結(jié)果見表5。保存試驗顯示，4 ℃條件下，12個月的S/P值基本恒定，故可以保存12個月。

表5 4 ℃條件下保存試驗（S/P值）

3 討論

PRV目前在國內(nèi)豬場廣泛流行，仔豬感染后呈急性發(fā)病并大量死亡，成年豬感染后臨床癥狀各異，包括腦炎、肺炎、流產(chǎn)，同時造成豬機(jī)體免疫力下降，對畜牧業(yè)威脅極大。目前偽狂犬病的防控主要靠gE基因缺失疫苗免疫。采用gE-ELISA對豬群進(jìn)行血清抗體檢測，可以有效區(qū)分疫苗抗體及感染抗體，對豬場偽狂犬病的防控具有重要意義。目前市面上很多gE-ELISA檢測試劑盒是基于5個抗原表位中1個或者2個建立的阻斷ELISA。但是gE抗原顯示出一定的抗原漂移性，并且豬個體之間對gE不同表位的抗體應(yīng)答也顯示出多樣性，因此阻斷ELISA可能會出現(xiàn)一些誤判[12-13]。鑒于這種情況，檢測全蛋白抗體的結(jié)合性ELISA，如間接ELISA或夾心ELISA則較有優(yōu)勢。這種方法不會受到gE表位特異性變化的影響。雖然gE蛋白在異體表達(dá)系統(tǒng)里面很難完全表達(dá)[14]，但是隨著對PRV gE蛋白的研究，其表位已被分析清楚[15]。

本研究通過原核表達(dá)gE蛋白中具有免疫原性抗原決定簇的基因片段，使包被抗原具有較好的敏感性及特異性。產(chǎn)品比對試驗中，將自制的間接ELISA方法對比國外的標(biāo)桿產(chǎn)品，顯示陽性符合率為88.03%，陰性符合率為91.47%，說明建立的間接ELISA方法敏感性和特異性良好；生物統(tǒng)計學(xué)顯示，不存在顯著性差異。同時，該檢測方法在時間上比國外標(biāo)桿產(chǎn)品縮短了近半個小時，更有利于在我國動物疫病防控一線市場推廣應(yīng)用。

4 結(jié)論

本研究以原核表達(dá)的PRV gE蛋白為包被抗原，通過建立并優(yōu)化間接ELISA方法，研制出了PRV間接ELISA抗體檢測試劑盒。與美國IDEXX生產(chǎn)的標(biāo)桿產(chǎn)品對比發(fā)現(xiàn)，該試劑盒的陽性符合率為88.03%，陰性符合率為91.47%，總體符合率為89.84%。批間和批內(nèi)重復(fù)性試驗表明，該試劑盒變異系數(shù)均小于10%，具有較好的重復(fù)性。該檢測試劑盒為豬場PRV野毒感染檢測提供了技術(shù)支撐，可用于豬場PRV野毒感染的臨床檢測。

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