廣西邊境地區(qū)活禽批發(fā)市場禽流感流行病學(xué)監(jiān)測

鄒聯(lián)斌，莫勝蘭，屈素潔，施開創(chuàng)，陸文俊，尹彥文，李 軍，鄧國華

（1. 廣西壯族自治區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心，廣西南寧 530001；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，黑龍江哈爾濱 150001）

廣西與越南毗鄰，陸地邊境線長1 020 km，海岸邊境線長1 595 km。由于缺乏天然屏障，中越邊境貿(mào)易與民間來往非常頻繁，動物及動物產(chǎn)品非法交易較為普遍，由此給雙邊的動物疫病控制帶來嚴(yán)重挑戰(zhàn)。

活禽批發(fā)市場是禽類的集聚地和周轉(zhuǎn)地，活禽來源十分復(fù)雜，其攜帶的病毒可隨禽類流動大范圍散播，因此活禽市場是禽流感等家禽疫病監(jiān)測的重點(diǎn)區(qū)域。作為廣西中越邊境重大動物疫病防控阻截帶建設(shè)的內(nèi)容之一，從2012年12月開始，對廣西邊境地區(qū)的主要活禽批發(fā)市場進(jìn)行了系統(tǒng)的禽流感監(jiān)測和調(diào)查。

1 材料與方法

1.1 材料

H1—H16亞型禽流感標(biāo)準(zhǔn)陽性血清：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所提供；RNA提取試劑盒 TaKaRa Mini BEST Viral RNA/DNA Extraction KitVer.5.0：購自大連寶生物工程有限公司；禽流感病毒H1～H16 亞型核酸檢測試劑盒（熒光PCR法）：購自上海之江生物科技股份有限公司；SPF雞胚：購自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 采樣地點(diǎn) 廣西 9 個(gè)邊境縣（市、區(qū)）的10個(gè)活禽批發(fā)市場。

1.2.2 采樣方法 2012年12月—2017年12月，以檢測或發(fā)現(xiàn)疾病為目的，采取“靶向抽樣+主觀抽樣”的混合抽樣方式，在每個(gè)活禽批發(fā)市場，每次采集約100份家禽拭子（水禽80份、雞20份）和20份環(huán)境拭子。每季度1次。

1.2.3 流行病學(xué)調(diào)查 在采集樣品的同時(shí)，收集市場基本信息，包括樣品來源、家禽流通情況以及生物安全管理狀況等數(shù)據(jù)。

1.2.4 病毒分離和鑒定 該部分試驗(yàn)在哈爾濱獸醫(yī)研究所國家禽流感參考實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。取拭子樣品處理液，按文獻(xiàn)[1]方法，尿囊腔接種 10 日齡 SPF雞胚（每個(gè)樣品接種 2 枚），37 ℃孵育，每天觀察2次；棄去24 h內(nèi)死亡的雞胚，及時(shí)收集 24 h 之后死亡的雞胚；至96 h，將所有雞胚置于4 ℃過夜；收集雞胚尿囊液，用血凝試驗(yàn)（HA）測定其 HA 效價(jià)；對有 HA 測定效價(jià)的雞胚尿囊液，先用 H1—H16亞型禽流感標(biāo)準(zhǔn)陽性血清進(jìn)行血凝抑制試驗(yàn)（HI）[2]，初步鑒定尿囊液中所含的禽流感病毒亞型；再用相應(yīng)的禽流感亞型鑒定核酸檢測試劑盒進(jìn)行熒光 RTPCR 試驗(yàn)，驗(yàn)證尿囊液中所含亞型禽流感病毒種類。HA和HI試驗(yàn)按照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 18936—2003的要求進(jìn)行操作；H1—H16亞型禽流感病毒熒光RT-PCR 試驗(yàn)按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)分析 用Microsoft excel軟件，統(tǒng)計(jì)分析樣品的病毒分離及亞型鑒定結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 禽流感監(jiān)測情況

2.1.1 病毒分離 2012 年12月—2017 年12月，在9個(gè)邊境縣的10個(gè)活禽批發(fā)市場，共采集樣品20次，采集樣品14 075 份，分離到禽流感病毒2 245株，病毒總分離率為15.95%；分離到的流感病毒亞型有 H1、H3、H4、H6、H7、H9、H10 和 H11等，其中以 H3、H6 和 H9 亞型最多（表1）。

表1 廣西邊境地區(qū)活禽批發(fā)市場禽流感病毒分離鑒定結(jié)果

2.1.2 時(shí)間分布 按公歷氣象劃分法，一般1月份為最冷月，7月份為最熱月；3—5月為春季，6—8月為夏季，9—11月為秋季，12月—2月（來年）為冬季[3]。監(jiān)測結(jié)果顯示：廣西邊境地區(qū)活禽批發(fā)市場一年四季都有A型禽流感病毒循環(huán)；冬季檢測樣品5 458份，分離到病毒962株，病毒分離率為17.63%（962/5 458）；春季檢測樣品2 020份，分離出病毒330株，病毒分離率為 16.34 %（330/2 020）；夏季檢測樣品1 722份，分離到病毒239株，病毒分離率為13.88 %（239/1 722）；秋季檢測樣品4 875份，分離到病毒714株，病毒分離率為14.65 %（714/4 875）。具體結(jié)果詳見表2。

表2 廣西邊境地區(qū)活禽交易市場禽流感病毒檢測結(jié)果按月份匯總

2.1.3 群間分布 家禽樣品中，鴨樣品的禽流感病毒分離率最高，為20.77 %（1 325/6 378）；鵝樣品次之，為 17.81 %（114/640）；雞樣品最低，為6.89 %（354/5 137）。在鴨樣品中分離到8種亞型病毒，數(shù)量從高到低依次為H6、H3、H9、H1、H4、H7、H10、H11；雞樣品中分離到6 種，依次為 H9、H6、H3、H10、H4、H1；鵝樣品中分離到 4種，依次為 H6、H3、H9、H4。水禽樣品中的H3、H6 亞型分離率高于雞；雞樣品中的 H9亞型分離率高于水禽。此外，在分離到的 2 245株禽流感病毒中，環(huán)境樣品中的454 株，病毒分離率為23.65 %（454/1 920），家禽樣品中的 1 791株，病毒分離率為 14.73 %（1 791/12 155），環(huán)境樣品病毒分離率高于家禽。

2.2 邊境活禽批發(fā)市場基本狀況

2.2.1 家禽貿(mào)易 廣西邊境地區(qū)的家禽消費(fèi)與整個(gè)華南地區(qū)一樣，以鮮活禽為主，因此活禽貿(mào)易比較頻繁。活禽年交易量在 100 萬只以上的縣（市、區(qū)）有：靖西縣（240萬）、憑祥市（109萬）、寧明縣（201萬）、防城區(qū)（103萬）、大新（156萬）。所有市場每天都開放，并將未銷售完的家禽留存在市場過夜。邊境縣（市、區(qū)）每天的家禽銷售量與人口數(shù)量呈正相關(guān)，也與節(jié)日有關(guān)。節(jié)日前1周，家禽流通量開始增加，節(jié)日當(dāng)天的銷售量比平時(shí)要多幾倍；每年農(nóng)歷六月初六和七月十四的鴨銷量最大。

2.2.2 家禽來源 廣西邊境地區(qū)活禽批發(fā)市場的家禽主要有4種：①本地養(yǎng)殖場（戶）家禽，由商販或養(yǎng)殖場用農(nóng)用車、微型車等交通工具運(yùn)到市場，或一些散養(yǎng)戶用自行車、摩托車將自己養(yǎng)殖的家禽運(yùn)到市場出售；②區(qū)內(nèi)規(guī)模養(yǎng)殖場家禽，主要來自欽州、玉林、南寧等市，由養(yǎng)殖場直接送到市場，一般是幾天運(yùn)輸一次。③區(qū)內(nèi)大型活禽批發(fā)市場家禽，主要是南寧、玉林、欽州和貴港等市的大型活禽批發(fā)市場轉(zhuǎn)運(yùn)過來的。④通過越南邊境走私進(jìn)來的家禽（圖1）。

圖1 廣西邊境家禽流通示意圖

2.2.3 活禽市場生物安全狀況 邊境地區(qū)大部分活禽市場沒有配備消毒和無害化處理設(shè)施，也未嚴(yán)格執(zhí)行休市制度，因而無法對市場進(jìn)行徹底消毒。

2.2.4 活禽屠宰情況 由于消費(fèi)活禽習(xí)俗，以及禽產(chǎn)品加工量小、家禽屠宰場不贏利等原因，廣西邊境地區(qū)沒有家禽屠宰場。家禽宰殺方式主要有兩種：一種是在活禽交易市場內(nèi)或周邊的家禽屠宰點(diǎn)宰殺；另一種是消費(fèi)者購買家禽后，直接帶回家自行宰殺。市場內(nèi)屠宰點(diǎn)的廢水被直接排放，廢棄物被當(dāng)作普通垃圾處理。

3 討論

經(jīng)過5年持續(xù)監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，廣西邊境地區(qū)10個(gè)活禽市場禽流感病毒總分離率為15.95 %。該結(jié)果低于黃建龍等[4]在湖南等地活禽交易市場的監(jiān)測結(jié)果（22.20%）；病毒分離率與氣候密切相關(guān)，冬春季節(jié)分離率高，夏秋季節(jié)次之。在活禽市場中，禽流感病毒分離率還與樣品來源密切相關(guān)。廣西邊境地區(qū) 10 個(gè)活禽市場環(huán)境樣品中的病毒分離率高達(dá)23.65 %，與梁能秀[5]在2010—2011年對廣西 14個(gè)市 62 個(gè)農(nóng)貿(mào)市場的環(huán)境監(jiān)測結(jié)果基本符合。本次監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，水禽中的病毒分離率遠(yuǎn)大于雞，揭示水禽是流感病毒的重要宿主。

與 Liu等[6]的監(jiān)測結(jié)果一樣，廣西邊境地區(qū)活禽批發(fā)市場也呈現(xiàn)多種亞型禽流感病毒共存的狀態(tài)。在所監(jiān)測的10個(gè)活禽批發(fā)市場中，都能分離到禽流感病毒，分離到的病毒亞型有8種，包括H1、H3、H4、H6、H7、H9、H10和 H11，其中H3和H6亞型數(shù)量最多。多亞型禽流感病毒長期在市場內(nèi)蓄積和循環(huán)，容易導(dǎo)致病毒發(fā)生基因重組變異，需要引起高度重視。

廣西邊境地區(qū)活禽批發(fā)市場家禽交易量大且頻繁，還有越南走私家禽流入，因而家禽來源較為復(fù)雜，而市場管理水平不高，生物安全措施不到位，使得活禽交易市場傳播禽流感病毒的風(fēng)險(xiǎn)較高[7]。因此，加強(qiáng)廣西邊境地區(qū)活禽市場禽流感監(jiān)測尤為重要。

4 結(jié)論

經(jīng)過長達(dá)5年的流行病學(xué)調(diào)查和禽流感監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，廣西邊境地區(qū)活禽批發(fā)市場家禽交易量大且頻繁，活禽來源復(fù)雜；禽流感病毒污染嚴(yán)重，多亞型病毒常年在市場內(nèi)蓄積和循環(huán)，且存在家禽隱性感染帶毒現(xiàn)象。這些主要是因市場管理水平不高和生物安全措施不到位造成的，因此需要加強(qiáng)市場的動物衛(wèi)生監(jiān)管，提高禽流感監(jiān)測力度。

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[5] 梁能秀. 廣西農(nóng)貿(mào)市場環(huán)境標(biāo)本禽流感病毒核酸檢測及亞型分布研究[D]. 南寧：廣西醫(yī)科大學(xué)，2012.

[6] LIU M，HE S，WALKER D，et al . The influenza virus gene pool in a poultry market in South central china[J].Virology，2003，305（2）：267-275.

[7] 王靖飛，李靜，吳春艷，等. 中國大陸高致病性禽流感發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)定量評估[J]. 中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2009，31（2）：89-93.