基于天冬氨酸的固定化金屬離子親和色譜材料用于磷酸化肽選擇性富集

申惠蓮, 卡哈爾5阿里木(1. 遼寧民族師范高等?？茖W(xué)校, 遼寧 沈陽 11003; . 新疆農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院, 新疆 昌吉 831100)

蛋白質(zhì)的磷酸化是最普遍、最重要的翻譯后修飾方式,與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和細(xì)胞凋亡等生物學(xué)過程密切相關(guān)[1-3]。異常的蛋白質(zhì)磷酸化與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[4]。因此研究蛋白質(zhì)磷酸化意義重大。生物樣品中磷酸化肽的含量非常低;在質(zhì)譜分析磷酸化肽時(shí),磷酸化肽的信號(hào)受到非磷酸化肽的抑制?；谏鲜鰞蓚€(gè)原因在質(zhì)譜檢測之前需要對(duì)磷酸化肽進(jìn)行高效富集。用于磷酸化肽的富集方法很多,主要包括金屬氧化物親和色譜(MOAC)[5,6]、固定化金屬離子親和色譜(IMAC)[7,8]和強(qiáng)陽離子交換色譜法[9]。其中,IMAC是應(yīng)用最廣泛的方法之一[10-13],但由于IMAC在富集磷酸化肽時(shí)存在酸性肽段的非特異性干擾,因此降低了對(duì)磷酸化肽的富集選擇性。這些酸性肽段中含有多個(gè)酸性氨基酸如天冬氨酸(Asp)和谷氨酸,如何克服這些酸性肽段的干擾是IMAC材料富集磷酸化肽所面臨的問題。針對(duì)這一問題,科研工作者從材料官能團(tuán)組成和親水性等方面做出改進(jìn),提高了IMAC材料對(duì)磷酸化肽的選擇性[14-16]。

氨基酸是生物功能大分子蛋白質(zhì)的基本組成單位。自然界里組成蛋白質(zhì)的20種氨基酸中只有2種酸性氨基酸,分別是天冬氨酸和谷氨酸。相比于谷氨酸,天冬氨酸的酸性和親水性更強(qiáng)。因此,本文應(yīng)用自然界中親水性、酸性氨基酸Asp作為IMAC材料的連接臂,通過點(diǎn)擊化學(xué)的方法在硅球上鍵合Asp(Click Asp),然后在此材料螯合上Fe3+后(Fe3+-Click Asp)用于磷酸化肽富集。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,所開發(fā)的基于Fe3+-Click Asp的IMAC材料能選擇性富集磷酸化肽。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與材料

硅球(5 μm, 10 nm)、α-酪蛋白(α-casein)、牛血清白蛋白(BSA)、二硫蘇糖醇(DTT)、碘乙酰胺(IAA)、鹽酸胍、胰蛋白酶、碳酸氫銨(NH4HCO3)、氨水(NH3. H2O)、丙烯酰氯、(3-巰基丙基)、甲酸銨(NH4FA)、甲酸(FA)、乙腈(ACN)和三甲氧基硅烷購于Sigma公司。所有溶液均用Milli-Q水配制。離心管和移液槍槍頭購于Axygen公司。超純水由美國Millipore公司Milli-Q超純水系統(tǒng)制備得到。

1.2 材料的制備和表征

按照文獻(xiàn)[17]合成Click Asp。反應(yīng)結(jié)束后,離心棄掉上層清液,于真空干燥箱中60 ℃干燥過夜。將真空干燥的硅球懸浮于15 mL無水乙醇中,超聲分散后,加入0.1 g九水硝酸鐵Fe(NO3)359H2O,室溫振蕩0.5 h。反應(yīng)結(jié)束后,于60 ℃干燥過夜,制備得到Fe3+-Click Asp。

所合成的材料分別經(jīng)如下儀器表征:日立SM-5610LV掃描電鏡(SEM)(日立高新技術(shù)公司);Vertex 80v傅里葉轉(zhuǎn)換紅外光譜儀(德國Bruker公司); Smart Lab9 X射線衍射分析儀(美國Smart Lab公司)。

1.3 蛋白質(zhì)的酶解

稱取1 mg蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品溶解于100 μL含8 mol/L尿素的50 mmol/L NH4HCO3緩沖液中,加入5 μL含200 mmol/L二硫蘇糖醇的25 mmol/L NH4HCO3緩沖液,于56 ℃條件下孵化45 min;加入20 μL含200 mmol/L碘代乙酰胺的25 mmol/L NH4HCO3緩沖液,暗室常溫反應(yīng)30 min;用25 mmol/L NH4HCO3緩沖液將溶液稀釋至10倍體積,并與30 μg胰蛋白酶充分混合后于37 ℃下反應(yīng)9 h,加入5 μL甲酸終止酶解反應(yīng),-80 ℃保存。

脫脂牛奶(產(chǎn)地德國)用3倍體積的乙腈沉淀,離心,棄去上清液,保留沉淀,用旋轉(zhuǎn)離心濃縮揮去乙腈。沉淀后的蛋白質(zhì)用8 mol/L尿素溶解后,采用上述蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的酶解過程進(jìn)行酶解。

HeLa細(xì)胞裂解液中蛋白質(zhì)的提取和胰蛋白酶的酶解參照文獻(xiàn)[18]進(jìn)行。

1.4 磷酸化肽的富集

稱取2.5 mg Fe3+-Click Asp材料,用30 μL ACN-H2O-FA(50∶49∶1,體積比)活化,用30 μL ACN-H2O-TFA(80∶19.9∶0.1,體積比)平衡,以30 μL ACN-H2O-TFA(80∶19.9∶0.1,體積比)為上樣溶液,溶解上樣(樣品為α-酪蛋白或者HeLa細(xì)胞裂解液的酶解物)后,依次用30 μL ACN-H2O-TFA (80∶19.9∶0.1,體積比)、30 μL ACN-H2O-TFA (50∶49.9∶0.1,體積比)、30 μL H2O淋洗,再用20 μL NH35H2O-H2O(5∶95,體積比)洗脫,然后進(jìn)行質(zhì)譜分析。

1.5 質(zhì)譜分析和搜庫

從α-酪蛋白和牛奶中富集的磷酸化肽采用納升級(jí)ESI Q-TOF MS (美國Waters公司)進(jìn)行分析;質(zhì)譜采用正離子(ESI+)掃描模式;納升級(jí)電噴霧電壓為2.3 kV;質(zhì)量掃描范圍為600～1 800 Da。從HeLa細(xì)胞裂解液中富集到的磷酸化肽采用液相色譜儀及LTQ-Orbitrap Velos質(zhì)譜儀(美國Thermo公司)進(jìn)行分析。肽段溶解在FA-H2O (0.1∶99.9,體積比)溶液中,上樣至捕獲柱(3 cm×100 μm, C18AQ色譜填料)。在納升級(jí)的分離柱(10 cm×75 μm, C18AQ色譜填料)上進(jìn)行梯度分離;流動(dòng)相A為FA-H2O(0.1∶99.9,體積比),流動(dòng)相B為ACN-H2O-FA(90∶9.9∶0.1,體積比),流速約為0.2 μL/min。洗脫梯度為:0～3 min, 2%B; 3～95 min, 35%B; 95～100 min, 50%B; 100～105 min, 90%B, 90%B保持5 min。

LTQ-Orbitrap Velos質(zhì)譜在正離子、Survery模式下采集數(shù)據(jù)。ESI噴針電壓為1.9 kV,碰撞能量為35%。MS掃描范圍為450～2 000 Da,分辨率為6 000,僅對(duì)豐度前15的離子進(jìn)行二級(jí)碎片掃描分析。將所采集的質(zhì)譜數(shù)據(jù)采用Maxquant軟件轉(zhuǎn)化為“*. mgf”文件,并在Uniprot數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行檢索。搜庫時(shí)參數(shù)設(shè)置如下:允許最多兩個(gè)漏切位點(diǎn);固定修飾設(shè)定為半胱氨酸被碘代乙酰烷基化,可變修飾為磷酸化;磷酸化肽的score>20,假陽性率<1%。

2 結(jié)果與討論

2.1 材料的制備和表征

所合成的材料分別采用傅里葉紅外光譜(FTIR)、X射線電子能譜(XPS)和SEM進(jìn)行表征。從紅外譜圖(圖1a)可以判斷3 450 cm-1處的峰為-NH-振動(dòng)峰,3 200 cm-1處寬而強(qiáng)的峰為羧基上-OH的伸縮振動(dòng),2 980 cm-1和2 850 cm-1處的峰為-CH3的對(duì)稱、不對(duì)稱伸縮振動(dòng)且包含-CH單鍵的振動(dòng)的峰,1 720 cm-1處的峰為酮上C=O的伸縮振動(dòng)(飽和)峰,1 490 cm-1處中等強(qiáng)度的峰為-CH2剪式振動(dòng),1 440 cm-1處的峰為羧基上C-O伸縮振動(dòng)峰。XPS譜圖表明所合成材料中含有C、N和Fe等元素的存在(見圖1b)。SEM譜圖說明硅球的形貌在修飾前后沒有發(fā)生顯著變化(見圖2),說明修飾沒有破壞硅球的形貌。上述這些結(jié)果表明Fe3+-Click Asp被成功合成。

圖 2 (a)硅球和(b)Fe3+-Click Asp材料的掃描電鏡圖Fig. 2 Images of (a) scanning electron microscope of silica microsphere and (b) the Fe3+-Click Asp materials

圖 3 α-酪蛋白的胰蛋白酶酶解液(a)處理前和經(jīng)過(b)TiO2和(c)Fe3+-Click Asp處理后的質(zhì)譜圖Fig. 3 Mass spectra of tryptic digests of α-casein (a) before and after treatment with (b) TiO2 and (c) Fe3+-Click Asp Phosphopeptides are labeled with xP. Other peaks are non-phosphorylated peptides. x indicates the number of phosphate group, and P indicates phosphate groups.

2.2 磷酸化肽富集方法的建立

因?yàn)镃lick Asp材料本身具有很好的親水性[17],所以Fe3+-Click Asp材料對(duì)磷酸化肽的富集實(shí)驗(yàn)在親水作用色譜的操作模式下進(jìn)行。我們以α-酪蛋白的胰蛋白酶酶解液為模式樣品,首先采用酸性、高有機(jī)溶劑的上樣溶液(ACN-H2O-TFA,80∶19.9∶0.1,體積比)降低酸性非磷酸化肽的吸附,接著降低乙腈的含量(ACN-H2O-TFA, 50∶49.9∶0.1,體積比)淋洗保留在材料上的非磷酸化肽,最后采用NH35H2O-H2O(5∶95,體積比)洗脫保留在材料上的磷酸化肽。結(jié)果如圖3所示,未經(jīng)過Fe3+-Click Asp處理的α-酪蛋白酶解液的質(zhì)譜圖中只能鑒定到一條磷酸化肽,大量高豐度的非磷酸化肽信號(hào)占據(jù)著整個(gè)質(zhì)譜圖,如m/z692.98(1+)、880.64(1+)和1 267.85(1+)等。同樣的α-酪蛋白的酶解液經(jīng)過Fe3+-Click Asp富集后,高豐度的非磷酸化肽被有效去除,使得磷酸化的信號(hào)顯著提高,能夠鑒定到15條磷酸化肽(具體信息見表1)的信號(hào),如m/z733.82(2+)、830.92(2+)、976.60(2+)、964.39(2+)和1 310.01(2+)。與此相比,采用磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)中廣泛使用的TiO2材料,我們只檢測到10條磷酸化肽的信號(hào)。上述結(jié)果表明我們合成的Fe3+-Click Asp能實(shí)現(xiàn)磷酸化肽的選擇性富集,其對(duì)磷酸化肽的富集效果優(yōu)于商品化的TiO2材料。

2.3 富集復(fù)雜生物樣品中的磷酸化肽

為了驗(yàn)證所建立的磷酸化肽富集方法在實(shí)際樣品中的效果,我們分別選取了脫脂牛奶和HeLa細(xì)胞裂解液作為分析對(duì)象。對(duì)于牛奶樣品,我們首先采用乙腈沉淀的方法從脫脂牛奶樣品中得到蛋白質(zhì),并對(duì)所得蛋白質(zhì)進(jìn)行酶解;然后采用Fe3+-Click Asp對(duì)牛奶蛋白酶解液中的磷酸化肽進(jìn)行富集。從圖4中可以看出,富集前的牛奶蛋白質(zhì)酶解液中只有一條磷酸化肽的信號(hào);與此相對(duì),經(jīng)過Fe3+-Click Asp富集后的質(zhì)譜圖中能檢測到17條磷酸化肽信號(hào),這些信號(hào)不僅包括m/z830.89(2+)、976.48(2+)、964.18(2+)、1 339.31(2+)和1 373.79(2+)等α-酪蛋白中的磷酸化肽,還鑒定到m/z1 041.24(3+)、1 044.56 (3+)、1 561.44 (2+)和1 580.43 (2+)等已報(bào)道的磷酸化肽。將Fe3+-Click Asp用于更加復(fù)雜的HeLa細(xì)胞裂解液,從50 μg樣品中共鑒定出1 855個(gè)磷酸化位點(diǎn),這些位點(diǎn)來源于1 269條磷酸化肽,方法的富集選擇性為65.8%。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明我們合成的Fe3+-Click Asp材料對(duì)磷酸化肽具有較高的富集選擇性。

表 1 α-酪蛋白胰蛋白酶酶解液中所含磷酸化肽的詳細(xì)信息Table 1 Detailed information of phosphopeptides contained in tryptic digests of α-casein

3 結(jié)論

本文合成了一種Fe3+-Click Asp用于磷酸化肽的富集,并應(yīng)用紅外光譜、X射線衍射電子能譜和掃描電鏡對(duì)材料進(jìn)行了表征,結(jié)果表明材料合成成功。此外,這種基于Fe3+-Click Asp的富集材料能實(shí)現(xiàn)磷酸化肽的選擇性富集。本工作為磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)的磷酸化肽富集提供了新材料和新方法。

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