超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定阿膠中馬、牛、羊、豬、駱駝、鹿皮源成分

杭寶建, 田晨穎, 陳 曉, 邢 晟, 石 峰*, 冷佳蔚*, 鞏麗萍*(. 山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院, 山東 濟(jì)南 500; . 山東中醫(yī)藥大學(xué), 山東 濟(jì)南 50355)

阿膠出現(xiàn)于先秦,至漢代已成為常用藥物,具有補(bǔ)血益氣、滋潤養(yǎng)顏、提高機(jī)體免疫力等功能,可用于失血貧血、缺鐵貧血、再生障礙貧血及年老體弱、兒童、婦女的滋補(bǔ)[1-4]。近年來,驢皮資源短缺,阿膠生產(chǎn)企業(yè)為了解決原料緊缺問題及降低成本,采用供應(yīng)量大的馬、牛、豬、羊、駱駝、鹿皮等低值皮進(jìn)行摻假,而現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)僅對(duì)牛皮源成分進(jìn)行控制,未控制上述其余雜皮的檢查,因此急需對(duì)現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行提升。

皮的主要成分膠原蛋白經(jīng)高溫熬制后成為不完全水解的肽段,不同物種的膠原蛋白經(jīng)胰蛋白酶酶切后可形成物種特異性的多肽[3-5]。本研究參考文獻(xiàn)[6-8],采用蛋白酶酶切技術(shù)和質(zhì)譜多肽識(shí)別技術(shù)建立了馬、牛、羊、豬、駱駝、鹿等非驢皮源成分的摻假鑒別方法,可有效控制阿膠摻假現(xiàn)象,提升產(chǎn)品品質(zhì)。

表 1 幾種動(dòng)物特征肽的序列及離子信息Table 1 Sequence and ion information of the marker peptides of several kinds of animals

* Quantitative ion.

本研究通過提取阿膠原材料驢皮及摻假馬、牛、豬、羊、駱駝、鹿等雜皮的膠原蛋白,采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),將驢皮與摻假皮源進(jìn)行蛋白質(zhì)組比對(duì),找出各雜皮的理論特征肽,同時(shí)采用高分辨質(zhì)譜結(jié)合蛋白搜庫技術(shù)對(duì)理論特征肽進(jìn)行序列及結(jié)構(gòu)的驗(yàn)證,根據(jù)確證的雜皮特征肽,采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法建立了馬、牛、羊、豬、駱駝、鹿等非驢皮源成分的摻假鑒別方法,可有效控制阿膠摻假現(xiàn)象,提升產(chǎn)品品質(zhì)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試藥

AB SCIEX Triple Quad 6500+超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(AB公司); KQ-300GDV型恒溫?cái)?shù)控超聲器(昆山市超聲儀器有限公司); Vortex-6渦旋振蕩器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)。

甲醇、乙腈均為色譜純(德國Merck公司)、甲酸為色譜純(美國Fisher公司),胰蛋白酶為優(yōu)級(jí)純(美國西格瑪公司),水為去離子水(Milli-Q純水系統(tǒng)生產(chǎn)),碳酸氫銨為分析純(上海國藥集團(tuán))。

對(duì)照品:馬皮特征肽、牛皮特征肽、羊皮特征肽、豬皮特征肽、駱駝皮特征肽、鹿皮特征肽對(duì)照品均由上海強(qiáng)耀生物有限公司合成,純度為98%。

樣品:研究用阿膠、馬、牛、羊、豬、駱駝、鹿皮膠樣品為實(shí)驗(yàn)室自制,其余阿膠樣品為日常監(jiān)督抽驗(yàn)樣品,共15批。

1.2 馬、牛、羊、豬、駱駝、鹿皮特征的序列鑒別

本工作參考文獻(xiàn)[9],通過提取阿膠原材料驢皮及摻假馬、牛、豬、羊、駱駝、鹿等雜皮的膠原蛋白,采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),將驢皮與摻假皮源進(jìn)行蛋白質(zhì)組比對(duì),找出各雜皮的理論特征肽,同時(shí)采用高分辨質(zhì)譜結(jié)合蛋白質(zhì)搜庫技術(shù)對(duì)理論特征肽進(jìn)行序列及結(jié)構(gòu)的驗(yàn)證,序列見表1。

1.3 色譜、質(zhì)譜條件

液相色譜條件:色譜柱為ACQUITY UPLC?BEH C18(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm),流速0.3 mL/min,流動(dòng)相A為0.1%甲酸溶液,B為0.1%甲酸乙腈溶液,梯度洗脫程序:0～3 min, 4%B; 3～8 min, 4%B～8%B; 8～15 min, 8%B～50%B; 15～16 min, 50%B; 16～16.1 min, 4%B; 16.1～25 min, 4%B;流速:0.3 mL/min。

質(zhì)譜條件:電噴霧離子源(ESI)正離子掃描模式,多反應(yīng)監(jiān)測(cè);離子源溫度:550 ℃。定性、定量離子對(duì)、錐孔電壓、碰撞能量見表1。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液及樣品溶液的制備

標(biāo)準(zhǔn)溶液:取研究用自制阿膠樣品0.1 g,置于50 mL量瓶中,加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為1%的NH4HCO3水溶液(1 g固體,加入100 mL水溶解)40 mL,超聲處理30 min,使樣品完全溶解并加1% NH4HCO3水溶液定容至刻度,搖勻,得阿膠基質(zhì)溶液。分別取馬、牛、羊、豬、駱駝、鹿皮特征肽適量,加阿膠基質(zhì)溶液制成各特征肽質(zhì)量濃度為2 μg/mL的溶液,作為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。系列標(biāo)準(zhǔn)溶液用阿膠基質(zhì)溶液配制,現(xiàn)用現(xiàn)配。

樣品溶液:取胰蛋白酶適量,加1% NH4HCO3溶液溶解,制成質(zhì)量濃度為1 μg/μL的胰蛋白酶溶液。取阿膠樣品0.1 g,置于50 mL量瓶中,加1% NH4HCO3溶液40 mL,超聲處理30 min,使樣品完全溶解并加入上述1% NH4HCO3溶液定容至刻度,過0.22 μm濾膜,取100 μL續(xù)濾液至300 μL微量進(jìn)樣瓶中,同時(shí)加入上述1 μg/μL的胰蛋白酶溶液10 μL,搖勻,37 ℃恒溫酶解12 h,即得。

表 2 幾種動(dòng)物特征肽的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限Table 2 Linear ranges, regression equations, correlation coefficients (R2), LODs and LOQs for the marker peptides of several kinds of animals

Y: peak area of marker peptide;X: mass concentration of marker peptide, mg/L.

2 結(jié)果與討論

2.1 特征肽的發(fā)現(xiàn)

阿膠中的主要成分為驢皮膠原蛋白水解后的多肽。皮類膠原蛋白主要由Ⅰ型膠原蛋白組成[10],占膠原蛋白總量的80%～85%,Ⅰ型膠原蛋白又包括Ⅰ型α1、α2亞型。通過對(duì)馬、牛、羊、豬、駱駝、鹿的Ⅰ型α1、α2膠原蛋白序列進(jìn)行blast多序列比對(duì),發(fā)現(xiàn)了膠原蛋白COL1α2之間的差異序列,進(jìn)一步模擬胰蛋白酶酶切膠原蛋白獲得物種相對(duì)的理論特征肽段。如果α1特征序列數(shù)據(jù)庫中沒有找到特征序列,就在α2中找,如果α2中沒有,則嘗試在其他類型膠原蛋白中找,最終找出理論特征肽,并通過高分辨質(zhì)譜對(duì)各特征肽進(jìn)行驗(yàn)證,各特征肽碎片歸屬均與數(shù)據(jù)庫中信息一致。

2.2 質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化

質(zhì)譜的錐孔電壓、碰撞能對(duì)待測(cè)物的裂解有重要的影響,配制100 ng/mL的各特征肽的單一標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行質(zhì)譜條件優(yōu)化:在電噴霧正離子模式下,通過蠕動(dòng)泵直接進(jìn)樣方式,確定待測(cè)物母離子;逐漸改變碰撞能量,通過觀察離子的豐度變化并與高分辨質(zhì)譜碎片歸屬相結(jié)合確定定量離子、定性離子;最終通過優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù),確定碎裂電壓及碰撞能量。

2.3 專屬性實(shí)驗(yàn)

以馬、牛、羊、豬、駱駝、鹿皮膠樣品為陽性樣品,以自制阿膠樣品為陰性樣品,選擇馬、牛、羊、豬、駱駝、鹿皮特征肽檢測(cè)離子對(duì)進(jìn)行測(cè)定[11,12],結(jié)果見圖1。在這幾種陽性樣品中,各特征肽對(duì)照品相應(yīng)的保留時(shí)間位置上均呈現(xiàn)出各相應(yīng)皮特征肽離子流色譜峰,兩兩間各特征肽互不檢出,說明每一特征肽相對(duì)于其他5個(gè)物種是具有特征性的。阿膠樣品的色譜圖中,在與馬、牛、羊、豬、駱駝、鹿皮膠樣品相應(yīng)的位置上均無相應(yīng)的色譜峰,因此認(rèn)為所選各特征肽具有一定的代表性,且阿膠樣品對(duì)測(cè)定無干擾。

圖 1 (a)阿膠和(b)幾種動(dòng)物特征肽對(duì)照品的MRM色譜圖Fig. 1 MRM chromatograms of (a) colla corii asini and (b) marker peptides of several kinds of animals

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍及檢出限

取系列標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣,按上述色譜條件測(cè)得峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo),各特征肽對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果表明各組分在0.02～2.0 mg/L內(nèi)線性關(guān)系良好,線性方程、相關(guān)系數(shù)見表2。在阿膠樣品中添加適量的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液后,以3倍信噪比計(jì)算檢出限,以10倍信噪比計(jì)算定量限,結(jié)果見表2。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一樣品,按1.4節(jié)方法平行制備6份供試品溶液,以監(jiān)測(cè)離子對(duì)進(jìn)行測(cè)定,馬、牛、羊、豬、駱駝、鹿皮膠特征肽峰面積的RSD分別為6.8%、6.1%、6.3%、 6.9%、6.9%和1.5%。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取研究用同一樣品,平行制備6份樣品溶液,將6份樣品置于-20 ℃條件下分別冷凍1天、7天、14天、30天、45天、60天后,融化后室溫進(jìn)樣,以監(jiān)測(cè)離子對(duì)進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果均可檢出各特征肽,說明酶解樣品在冷凍條件下60天內(nèi)均穩(wěn)定。

2.7 不同工藝對(duì)雜皮膠特征肽檢出的影響

由于阿膠生產(chǎn)廠家較多,各廠家之間工藝差別較大,因此實(shí)驗(yàn)?zāi)M了弱(100 ℃水解2 h)、中(120 ℃水解2 h)、強(qiáng)(125 ℃水解4 h)3種程度的熬膠條件,制備出不同制膠工藝下這幾種雜皮膠樣品,以各特征肽離子對(duì)進(jìn)行檢測(cè)。由表3結(jié)果可見,3種條件下制備的膠類樣品中均可以檢出相應(yīng)特征肽。

表 3 不同工藝對(duì)幾種動(dòng)物特征肽檢出的影響Table 3 Effects of different processes on the marker peptides of several kinds of animals

Weak: hydrolysis for 2 h at 100 ℃; middle: hydrolysis for 2 h at 120 ℃; strong: hydrolysis for 2 h at 125 ℃.

2.8 樣品測(cè)定

以所建立的方法對(duì)15批阿膠樣品進(jìn)行檢驗(yàn),結(jié)果表明,14批樣品檢出馬源性成分,6批樣品檢出牛源性成分,1批樣品檢出羊源性成分,2批樣品檢出豬源性成分,1批樣品檢出駱駝源性成分(見表4)。

表 4 阿膠樣品中雜皮源成分檢測(cè)結(jié)果Table 4 Test results of miscellaneous skin ingredients in colla corii asini samples

ND: not detected.

3 結(jié)論

本文建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定阿膠中馬、牛、羊、豬、駱駝、鹿皮源成分的檢測(cè)方法,樣品前處理操作簡(jiǎn)單,方法專屬性強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本方法具有較好的靈敏度、特異性和精密度,能滿足阿膠中雜皮源成分的檢測(cè)要求,15批日常抽檢阿膠樣品不同程度地檢出了摻假成分,因此非常有必要建立阿膠中雜皮源成分的檢測(cè)方法,以提升產(chǎn)品質(zhì)量,為阿膠品質(zhì)的監(jiān)控提供技術(shù)支持。

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