2,3-吡啶二甲酰亞胺及其工程菌轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的高效液相色譜檢測

鈕利喜, 馬師師(山西大學(xué)生物技術(shù)研究所, 教育部化學(xué)生物學(xué)與分子工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山西 太原 030006)

3-氨基甲?；?α-吡啶甲酸(3-carbamoyl-α-picolinic acid,α-3CP)作為一類重要的結(jié)構(gòu)單元,是合成藥物和現(xiàn)代農(nóng)藥時(shí)的一種通用有機(jī)合成中間體,具有廣闊的應(yīng)用前景,如利用它可以合成煙堿類殺蟲劑[1]。其化學(xué)合成主要是利用2,3-吡啶二羧酸(2,3-pyridinedicarboxylic acid, PDC)和氨合成2,3-吡啶二甲酰亞胺(2,3-pyridinedicarboximide, PDI),再通過PDI水解得到α-3CP[2]。但是PDI的水解反應(yīng)隨機(jī)發(fā)生于分子中兩個(gè)酰胺鍵中的一個(gè),生成α-3CP和2-氨基甲?；?β-吡啶甲酸(2-carbamoyl-β-picolinic acid,β-2CP)兩種水解產(chǎn)物。利用D-海因酶催化PDI水解可以特異地?cái)嗔哑渲械囊粋€(gè)酰胺鍵,只生成α-3CP,從而避免副反應(yīng)產(chǎn)物β-2CP的生成(見圖1)[3]。目前國內(nèi)尚未見對復(fù)雜環(huán)酰亞胺底物進(jìn)行酶催化轉(zhuǎn)化的報(bào)道。

圖 1 D-海因酶區(qū)域選擇性水解PDI為α-3CP的示意圖Fig. 1 Schematic diagram of regioselective hydrolysis of PDI catalyzed to α-3CP by D-hydantoinase PDI: 2,3-pyridinedicarboximide; α-3CP: 3-carbamoyl-α-picolinic acid.

環(huán)酰胺酶超家族(superfamily of cyclic amide hydrolases)是生物體內(nèi)重要的水解酶類之一,可水解不同的環(huán)酰胺鍵。根據(jù)底物專一性不同可將其分為環(huán)酰脲水解酶和環(huán)酰亞胺水解酶。環(huán)酰脲水解酶包括海因酶(hydantoinase)、二氫尿嘧啶酶、二氫乳清酸酶、尿囊素酶[4]。環(huán)酰亞胺水解酶一般作用于簡單的環(huán)酰亞胺,最適底物是含硫的環(huán)酰亞胺,生成相應(yīng)的半酰胺。海因酶的最適底物是海因或二氫尿嘧啶,其中少數(shù)海因酶還能作用于復(fù)雜的環(huán)酰亞胺[5,6]。

目前對D-海因酶的研究主要集中在利用其催化海因及其5′-單替代產(chǎn)物制備D-氨基酸,鮮有發(fā)現(xiàn)具有環(huán)酰亞胺水解酶活性的D-海因酶。我們從自行分離得到的一株原始菌株假單胞菌YZ26中克隆得到了一個(gè)D-海因酶基因,活性檢測表明其同時(shí)具有環(huán)酰亞胺水解酶活性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Breeze 1525型高效液相色譜儀(美國Waters公司),超純水發(fā)生器(Millipore公司), WD-9415B型超聲波清洗機(jī)(北京市六一儀器廠)。PDI(純度99%)、α-3CP(純度97%)、β-2CP(純度97%)為北京百靈威公司產(chǎn)品。含有D-海因酶基因的工程菌pET3a-hyd/BL21(DE3)為本室構(gòu)建保存。實(shí)驗(yàn)中所有用水均為超純水。

1.2 色譜條件

色譜分離柱:HypersilTMGOLD C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm);流動(dòng)相:H2O-乙腈(體積比為90∶10,含0.1%(體積分?jǐn)?shù))三氟乙酸);流速:1 mL/min;檢測波長:254 nm;柱溫為室溫。

1.3 樣品處理

標(biāo)準(zhǔn)溶液:精確稱取一定量的PDI、α-3CP和β-2CP,用超純水配制成0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mmol/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

反應(yīng)液制備:工程菌pET3a-hyd/BL21(DE3)發(fā)酵液經(jīng)異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)過夜誘導(dǎo)后,在9 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min,收集菌體細(xì)胞。再用H2O清洗菌體兩次后將其懸浮于飽和的PDI水溶液中,于37 ℃搖床160 r/min反應(yīng)適當(dāng)時(shí)間,用12 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min,取其上清進(jìn)行HPLC測定。在上述條件下,1 min內(nèi)轉(zhuǎn)化底物生成1 μmol產(chǎn)物所需酶量定義為一個(gè)酶活單位(U)。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)色譜圖

在1.2節(jié)色譜條件下,取1.0 mmol/L的PDI、α-3CP、β-2CP標(biāo)準(zhǔn)溶液等體積混合后取20 μL混合液上樣,得到3種標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖(見圖2),其中PDI的出峰時(shí)間為5.7 min,α-3CP的出峰時(shí)間為3.0 min,β-2CP的出峰時(shí)間為3.9 min。3種化合物達(dá)到了基線分離。

圖 2 PDI、α-3CP和β-2CP標(biāo)準(zhǔn)混合液的色譜圖Fig. 2 Chromatograms of the standard mixture of PDI, α-3CP and β-2CP

由于PDI在緩沖溶液中很容易發(fā)生自發(fā)水解,推測該酰胺鍵在PDI中不穩(wěn)定,因此在酸堿條件下容易發(fā)生自發(fā)水解,但該自發(fā)水解無特異性,在兩個(gè)酰胺鍵上隨機(jī)發(fā)生(見圖3)。而在水溶液中PDI、α-3CP、β-2CP都非常穩(wěn)定,因此我們選擇H2O作為整個(gè)反應(yīng)體系的溶劑。

圖 3 PDI在50 mmol/L PBS (pH 7.5)中自發(fā)水解Fig. 3 Autohydrolysis of PDI in 50 mmol/L PBS (pH 7.5)

2.2 工作曲線的制作

將配制好的PDI、α-3CP、β-2CP系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后進(jìn)行分析,結(jié)果各標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積Y與進(jìn)樣量X(μmol)的線性回歸方程如下:PDI,Y=5.01×107X+4.28×104,r2=0.999 6;α-3CP,Y=4.56×107X+4.20×105,r2=0.999 4;β-2CP,Y=4.427 84×107X+4.32×105,r2=0.999 1。表明線性關(guān)系良好。

2.3 D-海因酶水解PDI的色譜分析

工程菌pET3a-hyd/BL21(DE3)經(jīng)誘導(dǎo)后可以表達(dá)可溶性的重組D-海因酶蛋白,能專一性地水解PDI分子吡啶2位上的酰胺鍵,將其轉(zhuǎn)化為α-3CP。由于PDI在水中的溶解度較低,為了保證酶催化反應(yīng)始終處于最大反應(yīng)速度,我們在轉(zhuǎn)化體系中加入過量的PDI,保證在終止反應(yīng)時(shí)反應(yīng)液中仍然有過量的固體PDI,我們在1 mL轉(zhuǎn)化體系中加入由相同體積發(fā)酵液收集得到的菌體細(xì)胞,反應(yīng)30 min后離心取上清液進(jìn)行HPLC檢測酶催化產(chǎn)物α-3CP的生成(見圖4),利用標(biāo)準(zhǔn)曲線將峰面積換算成摩爾數(shù),測得工程菌中D-海因酶以PDI為底物時(shí)比活力為0.61 U/(mL510OD600 nm)。

圖 4 利用重組D-海因酶催化PDI生成α-3CPFig. 4 Generation of α-3CP by catalyzing PDI using recombinant D-hydantoinase

3 結(jié)論

通過建立HPLC快速檢測方法確認(rèn)我們重組表達(dá)的一種D-海因酶具有催化復(fù)雜環(huán)酰亞胺底物的能力,能夠特異性地水解底物分子兩個(gè)酰胺鍵中的一個(gè),生成相應(yīng)的半酰胺,該產(chǎn)物還能在半酰胺酶的催化下繼續(xù)轉(zhuǎn)化為二羧酸[7]。如果能通過一定的物理/化學(xué)助溶方法,或者建立新型的轉(zhuǎn)化體系,解決底物溶解度差的問題,該方法有望用于復(fù)雜的半酰胺和二羧酸有機(jī)物分子的工業(yè)化生產(chǎn)。

參考文獻(xiàn):

[1] Moriya K, Shibuya K, Hattori Y, et al. Biosci Biotech Biochem, 1993, 57(1): 127

[2] Luc I, Spiessens M, Marc J, et al. Bull Soc Chim Belg, 1980, 89: 205

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