親水相互作用色譜-串聯(lián)質譜法測定液體食品中14種甜味劑

范廣宇, 馮 峰, 張 峰*, 高 飛, 李曉明, 梁振綱(. 中國檢驗檢疫科學研究院食品安全研究所, 北京 0076; 2. 連云港出入境檢驗檢疫局, 江蘇 連云港 22202; . 濟南出入境檢驗檢疫局, 山東 濟南 2500; . 海南出入境檢驗檢疫局技術中心, 海南 ?？?570)

甜味劑是指能夠賦予食品甜味的一類食品添加劑,分為人工甜味劑和天然甜味劑。人工甜味劑因為成本低、甜度高已在食品加工中被廣泛應用,但長期過量食用人工合成甜味劑存在一定的安全風險,因而天然甜味劑受到人們的日益關注[1,2]。甜菊糖苷是從甜葉菊(SteviaRebaudiana(Bertoni) Hemsl.)葉子中提取出的一類天然甜味劑,其中含量比例最高的為甜菊苷(stevioside)和瑞鮑迪苷A(rebaudioside A),此外還包括其他結構類似物。瑞鮑迪苷A的甜度是蔗糖的450倍,而甜菊苷帶苦味[3]。我國《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》中規(guī)定了甜味劑的使用范圍和限量[4]。但在實際生產中存在違法添加甜味劑或者過量使用甜味劑的情況,因此亟須建立高通量、快速、靈敏的方法以檢測食品中的甜味劑。

食品中甜味劑的檢測方法主要有毛細管電泳法[5-7]、液相色譜法[8-11]和液相色譜-串聯(lián)質譜法等[12-19]。毛細管電泳法目前在甜味劑檢測中應用不多,不能滿足多種甜味劑同時檢測的需求;液相色譜法靈敏度低且容易受到基質干擾;液相色譜-串聯(lián)質譜法因具有強大的定性定量能力而被越來越多地應用于甜味劑的檢測中。目前,分離甜味劑多采用反相色譜法,但其存在分離效果不理想、需要在有機相中加入緩沖鹽和分離時間較長等問題。親水相互作用色譜(HILIC)是一種特殊的液相色譜分離模式,采用的是極性固定相和有機相含量較高的含水流動相。親水相互作用色譜可以保留在反相色譜中不保留或洗脫過快的強極性物質，也因流動相中有機溶劑含量高使得柱壓不會過高,從而可以改善某些極性物質的峰形,因此親水相互作用色譜更適合用于分離極性物質[20]。本研究建立了親水相互作用色譜-三重四極桿質譜快速、準確檢測飲料和白酒中6種人工合成甜味劑和8種甜菊糖苷類甜味劑的方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

1200高效液相色譜儀,配備自動進樣器、柱溫箱(美國Agilent公司); API5000三重四極桿質譜儀(美國AB Sciex公司); Analyst工作站;XP 105分析天平(瑞士Mettler公司); A10 Milli-Q超純水機(美國Millipore公司)。

甜蜜素(sodium cyclamate)、安賽蜜(acesulfame potassium)、糖精鈉(sodium saccharin)、三氯蔗糖(sucralose)、阿斯巴甜(aspartame)和紐甜(neotame)均購自德國Dr. Ehrenstorfer公司;甜菊苷、瑞鮑迪苷B(rebaudioside B)、瑞鮑迪苷D(rebaudioside D)、瑞鮑迪苷F(rebaudioside F)、杜克苷A(dulcoside A)均購自美國ChromaDex公司;瑞鮑迪苷A、瑞鮑迪苷C(rebaudioside C)和甜菊雙糖苷(steviolbioside)均購自北京百靈威公司。甲醇、乙腈(色譜純)和甲酸銨(優(yōu)級純)購自美國Fisher公司。飲料和白酒樣品均購自超市和電商平臺。

1.2 標準溶液的制備

準確稱取適量標準品,分別用水溶解并配制成質量濃度為1 000 mg/L的標準儲備液,于4 ℃儲存。分別移取14種甜味劑標準儲備液,用乙腈-水(70∶30, v/v)定容,配制成質量濃度為10 mg/L的混合標準溶液,于4 ℃儲存;使用時根據(jù)需要用乙腈-水(70∶30, v/v)稀釋至所需濃度。

1.3 樣品制備

準確稱取1 g樣品,用水稀釋至100 mL,過0.22 μm濾膜后上機測定。

1.4 色譜條件

色譜柱:Waters XBridge Amide色譜柱(150 mm×4.6 mm, 3.5 μm);柱溫:35 ℃;流動相:乙腈-10 mmol/L甲酸銨(65∶35, v/v);等度洗脫;流速:0.4 mL/min;進樣體積:5 μL。

1.5 質譜條件

離子源為電噴霧電離(ESI)源;多反應監(jiān)測(MRM)、負離子模式;實驗所用的氣體均為高純氮氣;碰撞氣(CAD)壓力為5 kPa;氣簾氣(CUR)壓力為25 kPa;霧化氣(GS1)壓力為55 kPa;輔助氣(GS2)壓力為60 kPa;電噴霧電壓(IS)為-4.5 kV;去溶劑溫度(TEM)為500 ℃;入口電壓(EP)為-10 V;碰撞室出口電壓(CXP)為-15 V。14種甜味劑的保留時間、監(jiān)測離子對、碰撞電壓(CE)和去簇電壓(DP)見表1。

2 結果與討論

2.1 質譜條件的優(yōu)化

本研究比較了正離子和負離子模式下各物質的響應值,發(fā)現(xiàn)在負離子模式下目標物的響應值明顯優(yōu)于正離子模式。除三氯蔗糖外,其他物質均選擇準分子離子作為母離子,然后選擇兩個子離子組成兩個監(jiān)測離子對,并對DP和CE進行優(yōu)化。當三氯蔗糖以[M-H]-(m/z395.3)的準分子離子為母離子進行子離子掃描時,逐漸增加CE值也只能得到一個豐度較大的子離子(m/z359.3),即準分子離子再失去一分子HCl后得到的碎片。由于三氯蔗糖結構中含有3個氯原子,根據(jù)天然同位素分布規(guī)律,[M+2-H]-(m/z397.3)的同位素離子豐度與準分子離子豐度相當,所以選擇m/z397.3>361.5作為另一個監(jiān)測離子對。優(yōu)化后的質譜參數(shù)見表1。

表 1 14種甜味劑的保留時間、監(jiān)測離子對、碰撞電壓和去簇電壓Table 1 Retention times, monitoring ion pairs, collision energies (CE) and declustering potentials (DP) of the 14 sweeteners

* Quantitative ion.

2.2 色譜條件的優(yōu)化

2.2.1色譜柱的選擇

目前報道[14-18]的甜味劑的檢測方法多使用C18色譜柱進行分離,但由于天然甜味劑的極性較強,在C18色譜柱上的保留效果并不好。因此本研究比較了Agilent ZORBAX SB-C18(150 mm×4.6 mm, 3.5 μm)和Waters XBridge Amide(150 mm×4.6 mm, 3.5 μm)兩種色譜柱對甜味劑的分離效果。結果表明,當使用Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱時,甜菊糖苷類甜味劑的保留效果和峰形均較差;當使用Waters XBridge Amide色譜柱進行分離時,14種甜味劑的分離度和峰形均較好,推測原因是Waters XBridge Amide色譜柱引入了酰胺基,使得其對強極性化合物有更強的保留能力。因此本實驗最終選擇Waters XBridge Amide色譜柱。

圖 1 無機相中甲酸銨和乙酸銨對14種甜味劑峰高和信噪比的影響Fig. 1 Effect of ammonium formate and ammonium acetate in inorganic phase on peak heights and S/N of the 14 sweeteners Nos. 1-14 are the same as that in Table 1.

2.2.2流動相的選擇

本研究還對流動相進行了考察和優(yōu)化。結果表明,流動相中有機相為乙腈時比為甲醇時能獲得更好的分離度和靈敏度。分別考察了采用不同無機相(10 mmol/L甲酸銨水溶液、10 mmol/L乙酸銨水溶液、0.1%(體積分數(shù))甲酸水溶液和超純水)時14種甜味劑的分離效果。當采用0.1%(體積分數(shù))甲酸水溶液和超純水時,14種甜味劑的色譜峰較寬,且峰拖尾嚴重;采用10 mmol/L甲酸銨水溶液和10 mmol/L乙酸銨水溶液時,大部分甜味劑的峰高相當,但信噪比前者明顯高于后者(見圖1)。因此本研究最終選擇乙腈-10 mmol/L甲酸銨水溶液作為流動相進行分離。

在優(yōu)化的條件下,14種甜味劑的提取離子色譜圖見圖2?？梢钥闯?在甜菊雙糖苷的提取離子色譜圖中有一強度相當?shù)姆?保留時間為6.76 min,與甜菊苷的保留時間一致,通過對比二者的結構可知,甜菊苷由甜菊雙糖苷結構上的羧基與β-Glc基團縮合而來,故其在質譜電離時也容易丟失β-Glc基團,產生的碎片離子(m/z641.8)進一步解離成m/z為479.7的碎片離子,產生與甜菊雙糖苷峰高相當?shù)姆?。類似的情況還有瑞鮑迪苷B，其提取離子色譜圖中有與瑞鮑迪苷A保留時間一致的色譜峰。

圖 2 14種甜味劑定量離子對的提取離子色譜圖Fig. 2 Extract ion chromatograms of the quantitative ion pairs of the 14 sweeteners

2.3 方法學評價

2.3.1線性關系、檢出限和定量限

在優(yōu)化的條件下,配制14種甜味劑的系列混合標準溶液(1～1 000 μg/L),以峰面積(Y)為縱坐標、質量濃度(X, μg/L)為橫坐標繪制標準曲線,得到的線性回歸方程和相關系數(shù)(r2)見表2。根據(jù)3倍和10倍信噪比確定方法的檢出限(LOD)和定量限(LOQ),結果見表2?？梢钥闯?14種甜味劑在各自的范圍內線性關系良好,相關系數(shù)均大于0.995。

表 2 14種甜味劑的線性范圍、回歸方程、相關系數(shù)、檢出限和定量限Table 2 Linear ranges, regression equations, correlation coefficients (r2), limits of detection and limits of quantification of the 14 sweeteners

Nos. 1-14 are the same as that in Table 1.Y: peak area;X: mass concentration, μg/L.

2.3.2精密度與回收率

在空白飲料樣品中添加2、5和20 mg/kg 3個水平的混合標準溶液,經1.3節(jié)所述方法處理后,每個水平重復測定6次,得到方法的回收率和精密度,結果見表3。3個添加水平下14種甜味劑的平均回收率為80.8%～108.7%,相對標準偏差為1.5%～7.7%(n=6)。

2.4 實際樣品測定

將方法應用于市場上購買的8種飲料和2種白酒中甜味劑的檢測,有3種飲料樣品中有甜味劑的檢出,其中1種飲料中檢出人工合成甜味劑三氯蔗糖,2種飲料中有天然甜味劑的檢出,含量均符合GB 2760-2014的要求,詳細結果見表4。

表 3 14種甜味劑的回收率和精密度(n=6)Table 3 Recoveries and precisions of the 14 sweeteners (n=6)

表 4 實際樣品的測定結果Table 4 Detected results of the real samples

3 結論

本研究建立了親水相互作用色譜-三重四極桿質譜檢測飲料和白酒中14種甜味劑的分析方法。該方法樣品前處理簡單,分析速度快,精密度和靈敏度高,能夠同時測定飲料和白酒等液體食品中14種甜味劑。該方法有望在食品甜味劑的檢測中發(fā)揮重要作用。

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