CFW熒光染色法檢測疑似真菌感染的臨床應(yīng)用評價

何文婧， 高志琴， 陳 健， 任弘謹(jǐn)， 楊 虹， 蔡 晴， 楊連娟

（上海市皮膚病醫(yī)院，上海 200050）

熒光染色劑Calcofluor White（CFW）能與真菌細(xì)胞壁的纖維素、幾丁質(zhì)和其他含β-1，4-糖苷鍵的碳水化合物緊密結(jié)合[1]，可吸收紫外光，使菌絲和孢子發(fā)出明亮的熒光，在熒光顯微鏡下真菌輪廓與黑暗的背景對比明顯。國外實驗室早已將熒光顯微鏡用于真菌性角膜炎等疾病病原真菌的檢測[2]，而國內(nèi)實驗室由于早年缺乏熒光顯微鏡，一直沿用KOH濕片鏡檢法加真菌培養(yǎng)法來檢測真菌。但真菌培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)檢測耗時長，傳統(tǒng)KOH濕片鏡檢法假陽性率高，使這2種方法均不能滿足臨床需要。本研究對疑似真菌感染患者的臨床樣本同時進(jìn)行了KOH濕片鏡檢法、CFW熒光染色法和真菌培養(yǎng)法檢測，以評價CFW熒光染色法檢測疑似真菌感染的臨床價值。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取上海市皮膚病醫(yī)院門診疑似真菌感染患者共155例，其中男79例、女76例，年齡（42.0±17.6）歲。采集腹股溝、指（趾）甲、頭、手、足、胸、龜頭包皮等部位的樣本和白帶等。每例樣本分別采用KOH濕片鏡檢法、CFW熒光染色法和真菌培養(yǎng)法檢測。在進(jìn)行真菌培養(yǎng)時，每例樣本接種于2管沙氏葡萄糖蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基（sabouraud dextrose agar，SDA）上，26 ℃培養(yǎng)2～3周。

1.2 試劑

熒光染色劑CFW購自石家莊博洋生物科技有限公司（批號20160613）。溶液A主要由熒光增白劑、氫氧化鉀和水組成，高濃度的熒光素與真菌細(xì)胞壁的主要成分幾丁質(zhì)相結(jié)合，標(biāo)記熒光。溶液B為復(fù)染劑，由伊文思藍(lán)和水組成，復(fù)染劑可降低樣本組織的背景亮度，增加對比度，使熒光信號更加清晰。10%/20%KOH溶液由KOH和水配制而成。指（趾）甲或角質(zhì)層較厚的皮屑用20%KOH溶液溶解，其他樣本用10%KOH溶液溶解。KOH能溶解臨床樣本中的角質(zhì)，使組織透明。

1.3 方法

采集每例患者3份適量樣本，分別用于KOH濕片鏡檢法、CFW熒光染色法、真菌培養(yǎng)法檢測。

1.3.1 KOH濕片鏡檢法 取適量臨床樣本置于載玻片上，加1滴KOH溶液，蓋上蓋玻片。放置片刻或在酒精燈火焰上微加熱，即在酒精燈火焰上快速通過2～3次，不應(yīng)使其沸騰，以免結(jié)晶，然后輕壓蓋玻片，驅(qū)逐氣泡、壓薄樣本。先在低倍鏡下檢查有無菌絲和孢子，然后用高倍鏡觀察孢子和菌絲的形態(tài)、特征、位置、大小和排列方式等。

1.3.2 CFW熒光染色法 將載有臨床樣本的載玻片放置在水平操作臺上，直接向樣本上滴加1滴溶液A，靜置1 min，如樣本的角質(zhì)化程度較高，需靜置2 min，可適當(dāng)加熱，以不沸騰為度。 滴加溶液B 1滴，靜置1 min。 蓋上蓋玻片，輕輕壓蓋玻片，用棉簽吸去多余的染色劑。將樣本置于CX23熒光顯微鏡（日本Olympus公司）下觀察：先用低倍鏡找到樣本所在位置，再用高倍鏡尋找菌絲或孢子等結(jié)構(gòu)加以證實。

1.3.3 真菌培養(yǎng)與鑒定 將臨床樣本分別接種于含有50 μg/mL氯霉素的SDA和含有500 μg/mL放線菌酮的SDA上，置26 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2～3周。絲狀真菌通過菌落特征和顯微鏡下特征鑒定，念珠菌通過轉(zhuǎn)種科馬嘉念珠菌顯色培養(yǎng)基或用API20CAUX測試板條鑒定。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。采用χ2檢驗比較CFW熒光染色法與KOH濕片鏡檢法的檢測結(jié)果，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3種方式對不同疾病患者樣本的檢測結(jié)果

155例患者不同部位樣本的真菌檢測結(jié)果顯示，CFW熒光染色法陽性率（85.8%）最高，KOH濕片鏡檢法陽性率（76.1%）次之，二者差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=14.45，P＜0.05）。真菌培養(yǎng)法陽性率（71.0%）最低。其中，脂溢性皮炎、生殖器念珠菌病、馬拉色菌性毛囊炎等患者的皮屑在鏡下可見少量或大量孢子，CFW熒光染色法對孢子鏡檢的陽性率明顯高于KOH濕片鏡檢法；對于手足癬、體股癬和頭癬患者，CFW熒光染色法與KOH濕片鏡檢法陽性率相當(dāng)；CFW熒光染色法對甲真菌病患者檢測的陽性率（100.0%）稍高于KOH濕片鏡檢法（89.5%）。見表1。

表1 不同疾病患者3種方法的真菌檢測結(jié)果[例（%）]

2.2 不同菌種CFW熒光染色法與KOH濕片鏡檢法陽性率比較

對155例患者皮屑進(jìn)行真菌培養(yǎng)，其中107例真菌培養(yǎng)陽性并做真菌菌種鑒定。對比不同菌種KOH濕片鏡檢法與CFW熒光染色法的陽性率，發(fā)現(xiàn)2種方法檢測皮膚癬菌與非皮膚癬菌真菌的陽性率差異不大，而CFW熒光染色法對酵母的陽性率明顯高于KOH濕片鏡檢法。見表2。

2.3 不同感染部位樣本的熒光染色鏡下形態(tài)

不同感染部位樣本的熒光染色鏡下形態(tài)見圖1～6。

圖1 甲癬熒光染色鏡下形態(tài)

圖2 花斑糠疹熒光染色鏡下形態(tài)

圖3 足癬熒光染色鏡下形態(tài)

圖4 毛囊炎熒光染色鏡下形態(tài)

圖5 頭癬熒光染色鏡下形態(tài)

圖6 毛囊蟲熒光染色鏡下形態(tài)

3 討論

淺部真菌感染的診斷主要依賴于臨床樣本的真菌直接鏡檢和培養(yǎng)[3]。在傳統(tǒng)真菌感染的診斷中，KOH濕片鏡檢法是最簡單、最經(jīng)濟(jì)的方法，但該法的準(zhǔn)確檢測需要有經(jīng)驗的檢驗工作者，降低把細(xì)胞壁、纖維誤認(rèn)為菌絲[4-5]，把氣泡和油滴誤認(rèn)為孢子的概率才能實現(xiàn)。真菌培養(yǎng)結(jié)果與皮屑采集的質(zhì)量、數(shù)量及患者的近期用藥情況均息息相關(guān)，且耗時長。在本研究中，真菌培養(yǎng)法在真菌性疾病的診斷中陽性率最低。真菌熒光染色劑CFW為二苯乙烯類化合物，是一種非特異性熒光染料，能夠非特異性地結(jié)合β-1，3-糖苷鍵和β-1，4-糖苷鍵連接的多糖，如幾丁質(zhì)、葡萄糖、纖維素。在熒光顯微鏡下，發(fā)散光和激發(fā)光波長在355 nm時，真菌發(fā)出明亮的藍(lán)色熒光，而其他成分呈微弱的灰藍(lán)色，是能快速檢測真菌的新型染色劑，適用于各種疑似真菌感染的檢查，如體股癬、手足癬、頭癬、甲癬和花斑糠疹等，也可與各類真菌結(jié)合而發(fā)出熒光，包括毛癬菌、念珠菌、馬拉色菌及曲霉等。本研究在CFW熒光染色法真菌鏡檢過程中偶見明顯的毛囊蟲蟲體（圖6），與周圍背景形成鮮明對此，蟲體形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰，由此可見CFW熒光染色法也可用于臨床毛囊蟲的檢查。

KOH溶液使真菌在組織皮屑中更明顯，熒光染色劑因結(jié)合真菌細(xì)胞壁的多糖等成分而使真菌檢測更具敏感性和特異性[6-7]，尤其在酵母感染性真菌病的診斷中效果更好。RAMOS等[8]的研究表明馬拉色菌分離培養(yǎng)非常困難和低效，但CFW熒光染色法為馬拉色菌病提供了一種快速、有效的早期診斷方法。BHAVASAR等[9]研究顯示，在眾多念珠菌檢測方法中CFW熒光染色法更具可靠性和敏感性。

以往的文獻(xiàn)已證實熒光染色法在真菌檢測中較傳統(tǒng)的KOH濕片鏡檢法具有敏感性強(qiáng)、陽性率高的優(yōu)點[10-12]。CFW熒光染色法檢測淺部真菌病快速、有效、簡便，值得在臨床推廣應(yīng)用。臨床上也可同時結(jié)合KOH濕片鏡檢法和真菌培養(yǎng)法，使真菌檢測結(jié)果更加直觀和準(zhǔn)確。

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