植物血凝素刺激外周血單個(gè)核細(xì)胞Th1/Th2細(xì)胞因子分泌對(duì)阿爾茨海默病的診斷價(jià)值

丁冰玉， 林 萍， 李擎天

（1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院檢驗(yàn)系，上海 200025；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬精神衛(wèi)生中心，上海 200030）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease，AD）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的退行性疾病，通常表現(xiàn)為記憶功能和認(rèn)知功能的進(jìn)行性喪失，伴隨著人格和行為的改變。其特征性病理改變?yōu)榈矸蹣应碌鞍祝╝myloid-beta protein，Aβ）沉積形成的細(xì)胞外老年斑（senile plaque，SP）和tau蛋白過度磷酸化形成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)[1]。目前，AD尚無明確的診斷試驗(yàn)，只能在患者死亡后通過顯微鏡觀察SP和神經(jīng)原纖維纏結(jié)的存在來準(zhǔn)確診斷。

大量研究證據(jù)支持，伴隨著神經(jīng)退行性變化，機(jī)體產(chǎn)生的免疫應(yīng)答對(duì)AD發(fā)生、發(fā)展有重要作用[2]。MüLLER等[3]推測(cè)Th1和Th2激活的不平衡可產(chǎn)生N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid，NMDA）受體激動(dòng)劑——喹啉酸，其對(duì)神經(jīng)細(xì)胞有毒性作用。在此背景下，研究免疫細(xì)胞Th1/Th2分泌的細(xì)胞因子對(duì)AD的診斷意義具有可行性。此外，膽固醇代謝在AD的病理生理中也起到了一定的作用。有研究表明，膽固醇高的受試者對(duì)AD的易感性增加，降脂藥物對(duì)AD的治療可能有一定的作用[4-7]。

本研究收集AD患者和健康對(duì)照者的血液樣本，抽提外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），在植物血凝素（phytohaemagglutinin，PHA）刺激下培養(yǎng)，檢測(cè)培養(yǎng)基上清液中的細(xì)胞因子水平，同時(shí)檢測(cè)血清細(xì)胞因子及血脂水平，分析各指標(biāo)對(duì)AD的診斷價(jià)值，并在6周后重復(fù)采樣，以探究指標(biāo)是否具有穩(wěn)定性。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

收集2015年9月—2016年10月上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬精神衛(wèi)生中心的AD患者樣本100例。AD患者簡易精神狀態(tài)檢查（Mini-Mental State Examination，MMSE）評(píng)分≤24，入組的患者需排除以下情況：有并發(fā)感染史；伴隨或過去有炎癥和/或自身免疫性疾病史；之前發(fā)生過短暫性大腦缺血性發(fā)作、腦卒中和/或其他腦血管病；存在嚴(yán)重頑固性心力衰竭、嚴(yán)重腎臟疾病或晚期慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）；有癌癥或血液腫瘤史；伴隨的已知影響認(rèn)知的醫(yī)學(xué)、神經(jīng)或精神疾??；有重大頭部創(chuàng)傷史；近期做過重大手術(shù)；在過去24 h內(nèi)攝入過抗菌藥物；在過去2個(gè)月內(nèi)攝入過降脂藥物；有酗酒和/或?yàn)E用藥物史；意識(shí)水平受到干擾[8]。AD患者男42例、女58例，年齡（72±11）歲。對(duì)照組100例樣本來自上海市閔行區(qū)中心醫(yī)院的健康體檢者，其中男49名、女51名，年齡（70±9）歲。對(duì)照組MMSE評(píng)分為30分，排除標(biāo)準(zhǔn)同AD組。

1.2 方法

清晨空腹抽取抗凝全血4 mL，AD組于6周后同一時(shí)間點(diǎn)再次抽取血樣。AD組根據(jù)不同采樣時(shí)間，按先后順序分別記為AD1、AD2。采用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法分離PBMC，利用臺(tái)盼藍(lán)試驗(yàn)確定活細(xì)胞的數(shù)量。PBMC以106/mL濃度重懸于RPMI-1640培養(yǎng)基中，在PHA（10 μg/mL）刺激下，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)48 h。48 h后收集培養(yǎng)上清液，-80 ℃凍存。采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）（試劑盒購自北京四正柏生物科技有限公司）對(duì)PBMC在PHA刺激下分泌的白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1α、IL-6、IL-10、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）、γ干擾素（interferon gamma，IFN-γ）和血清IL-1α（serum IL-1α，sIL-1α）、血清IL-6（serum IL-6，sIL-6）、血清IL-10（serum IL-10，sIL-10）、血清TNF-α（serum TNF-α，sTNF-α）、血清IFN-γ（serum IFN-γ，sIFN-γ）進(jìn)行測(cè)定。血脂[總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）]水平用UNCEL DXC800全自動(dòng)生化分析儀（美國貝克曼庫爾特公司）進(jìn)行測(cè)定。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，各指標(biāo)診斷效能的評(píng)估采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AD組和對(duì)照組PBMC在PHA刺激下分泌的細(xì)胞因子水平的比較

AD組PHA刺激下的IL-1α、IFN-γ水平明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），而IL-10水平明顯低于對(duì)照組（P＜0.05）；IL-6、TNF-α與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；6周后重新采樣檢測(cè)，結(jié)果與第1次一致。見圖1。

2.2 AD組和對(duì)照組血清細(xì)胞因子水平的比較

AD組sIL-6、sTNF-α水平明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），sIL-1α、sIL-10及sIFN-γ與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。6周后重新采樣檢測(cè)，結(jié)果與第1次一致。見圖2。

圖1 AD組和對(duì)照組PBMC在PHA刺激下分泌的細(xì)胞因子水平的比較

2.3 AD組和對(duì)照組血脂水平的比較

AD組血清TC、TG及LDL-C明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），而HDL-C在2個(gè)組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。6周后重新采樣檢測(cè)，結(jié)果與第1次一致。見表1。

圖2 AD組和對(duì)照組血清細(xì)胞因子水平的比較

表1 AD組和對(duì)照組血脂水平的比較 （mmol/L，±s）

表1 AD組和對(duì)照組血脂水平的比較 （mmol/L，±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05

組別 例數(shù) TC TG LDL-C HDL-C AD組AD1 100 6.25±0.77* 2.20±0.63* 4.18±0.78* 1.42±0.41 AD2 100 6.33±1.03* 2.27±0.41* 4.32±0.94* 1.42±0.57對(duì)照組 100 5.27±0.63 1.46±0.69 3.36±0.62 1.47±0.79

2.4 ROC曲線分析

分析IFN-γ、IL-1α、sIL-6、sTNF-α、TC、TG、LDL-C對(duì)AD的診斷價(jià)值，同時(shí)以IFN-γ代表Th1介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，IL-6和IL-10代表Th2介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，利用細(xì)胞因子的比值分析Th1/Th2改變?cè)贏D診斷中的敏感性和特異性，評(píng)價(jià)這種改變作為生物標(biāo)志物指導(dǎo)AD診斷的意義，結(jié)果見圖3，其分析結(jié)果及特征性參數(shù)見表2。

圖3 評(píng)價(jià)Th1/Th2、IFN-γ、IL-1α、sIL-6、sTNF-α及血清TC、TG、LDL-C對(duì)AD診斷價(jià)值的ROC曲線

表2 ROC曲線評(píng)價(jià)Th1/Th2、IFN-γ、IL-1α、sIL-6、sTNF-α及血清TC、TG、LDL-C對(duì)AD診斷價(jià)值的特征性參數(shù)

3 討論

AD是最常見的神經(jīng)退行性癡呆，其發(fā)生、發(fā)展涉及遺傳、環(huán)境和生理因素[9]。隨著年齡的增長，老年人體內(nèi)的血流量及灌注減少，導(dǎo)致活性氧產(chǎn)生和氧化應(yīng)激失衡，炎癥細(xì)胞因子生成增加。細(xì)胞因子可影響淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein，APP）的表達(dá)和促淀粉樣變性過程和/或β-淀粉樣蛋白聚集[10]，導(dǎo)致AD患者大腦的認(rèn)知區(qū)域Aβ異常聚集、增加，刺激免疫系統(tǒng)，誘發(fā)炎癥反應(yīng)的正反饋過程，造成細(xì)胞的不可逆損傷[11]。細(xì)胞因子還可影響激酶活性，進(jìn)而導(dǎo)致tau蛋白磷酸化異常[10]。有學(xué)者提出，AD患者出現(xiàn)的認(rèn)知障礙可能是由細(xì)胞因子介導(dǎo)的神經(jīng)元與膠質(zhì)細(xì)胞之間的相互作用造成的[12]。

本研究關(guān)注AD患者PBMC在PHA刺激下的Th1/Th2細(xì)胞因子水平，PBMC可通過血腦屏障到達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng)，發(fā)揮免疫功能[13]。本研究結(jié)果也顯示AD組PHA刺激下的IFN-γ水平明顯高于對(duì)照組（P＜0.05）。有研究表明，在促炎性細(xì)胞因子IFN-γ的刺激下，被淀粉樣斑塊包繞的小膠質(zhì)細(xì)胞吲哚胺-2，3-二氧化酶（indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO）過表達(dá)[14]。IDO是犬尿氨酸途徑（kynurenine pathway，KP）的限速酶，影響著色氨酸（tryptophan，TRP）的代謝。IDO的過度表達(dá)可引起KP調(diào)節(jié)異常，TRP向犬尿素（kynurenine，KYN）合成增加，TRP及其代謝產(chǎn)物具有神經(jīng)毒性，與神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)[4，14]。本研究結(jié)果顯示AD患者PBMC分泌的IFN-γ增加，推測(cè)其增加引起了IDO過表達(dá)，神經(jīng)毒性喹啉酸產(chǎn)生增加，引起神經(jīng)元變性，造成了疾病的發(fā)生、發(fā)展。

本研究結(jié)果還顯示IL-6和IL-10趨向下降，而IFN-γ趨向上升，由此推測(cè)PHA刺激下細(xì)胞因子的產(chǎn)生模式更傾向于Th1介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。6周后重復(fù)收集樣本檢測(cè)，結(jié)果顯示2個(gè)時(shí)間點(diǎn)PHA刺激的PBMC細(xì)胞因子分泌情況一致，提示這種Th1/Th2改變?cè)贏D患者中處于穩(wěn)定狀態(tài)，表明可以將這種改變作為AD的生物標(biāo)志物。PHA刺激下PBMC分泌的IFN-γ、IL-1α水平診斷AD的AUC為0.911、0.644，說明IFN-γ水平對(duì)AD有一定的診斷價(jià)值；Th1/Th2（IFN-γ/IL-6比值、IFN-γ/IL-10比值）診斷AD的AUC分別為0.951、0.912，說明Th1/Th2改變對(duì)AD有診斷價(jià)值，IFN-γ/IL-6比值對(duì)AD的診斷價(jià)值比IFN-γ/IL-10比值更高，且Th1/Th2改變的診斷價(jià)值比單個(gè)細(xì)胞因子水平的診斷價(jià)值更高。

本研究還對(duì)AD患者血清細(xì)胞因子進(jìn)行了測(cè)定，發(fā)現(xiàn)sIL-6、sTNF-α水平明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），這與文獻(xiàn)報(bào)道[15-18]一致，且sIL-6、sTNF-α診斷AD的AUC為0.894、0.888。由此可見，sIL-6、sTNF-α水平均對(duì)AD有一定的診斷價(jià)值，但診斷價(jià)值低于PHA刺激下PBMC分泌的IFN-γ水平。

正常機(jī)體內(nèi)的APP由α-內(nèi)分泌酶催化裂解生成可溶性蛋白片段，而由β-內(nèi)分泌酶催化生成Aβ。在高膽固醇水平下，α-內(nèi)分泌酶活性受到一定抑制，APP經(jīng)由β-內(nèi)分泌酶催化增多，Aβ生成增加[6]。有研究表明，血脂代謝異常還顯著影響tau蛋白過度磷酸化，從而導(dǎo)致AD的發(fā)生[5]。本研究中AD患者TC、TG以及LDL-C水平明顯高于對(duì)照組，且指標(biāo)的升高在6周后仍能被檢測(cè)到。TC、TG、LDL-C診斷AD的AUC分別為0.912、0.911、0.897，結(jié)合老年人因代謝水平降低引起的血脂生理性升高，提示這3項(xiàng)指標(biāo)可作為AD的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估指標(biāo)。

綜上所述，PHA刺激下PBMC的IFN-γ等細(xì)胞因子分泌水平、血清細(xì)胞因子水平及血脂水平異?？赡芘cAD發(fā)病相關(guān)，其中PHA刺激的IFN-γ及sIL-6、sTNF-α、TC、TG、LDL-C水平對(duì)AD有一定的診斷價(jià)值。

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