催產素減輕新生大鼠海馬神經元缺氧缺血性損傷*

謝常寧， 吳 儉▲， 王欣萌， 彭斯聰， 吳 靜， 肖凌慧， 柳 濤, 2, 3△

(南昌大學第一附屬醫(yī)院 1兒科， 2醫(yī)學科研中心， 3江西省分子診斷與精準醫(yī)學重點實驗室， 江西 南昌 330006)

圍生期窒息所引起的新生兒缺氧缺血性腦病(neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy，NHIE)常并發(fā)多種神經系統(tǒng)后遺癥，如腦癱[1]，嚴重危害兒童健康。目前治療手段有限且療效不佳[2-3]，因此探求NHIE治療的新途徑迫在眉睫。

海馬是NHIE最常累及的部位，其主要原因有：(1)腦缺血后，腦血流二次重新分配導致海馬梗死；(2)N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid，NMDA)型谷氨酸受體在海馬CA1區(qū)高度表達，易引起興奮性毒性，使其對缺氧缺血尤其敏感[4]。海馬CA1區(qū)是海馬神經環(huán)路的最后一站，對維持海馬的正常功能(如學習和記憶)具有重要作用[5]。因此，減少缺氧缺血所導致的海馬CA1區(qū)神經元損傷是治療NHIE的關鍵。

抑制性突觸傳遞可拮抗神經元NMDA受體激活導致的興奮性毒性，對局部神經環(huán)路的穩(wěn)定具有重要作用。γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)是大腦內最主要的抑制性神經遞質，使其信號增強的藥物，如唑吡坦和氯鎂噻唑等，均被證實對缺氧缺血后的神經元損傷具有保護作用[6-7]。催產素(oxytocin)是一種由下丘腦室旁核和視上核的大細胞所合成的古老的神經肽，具有分娩發(fā)動和乳汁分泌等作用而被長期應用于臨床。在海馬中，催產素可增強幼年(3～5周齡)大鼠海馬CA1區(qū)椎體神經元GABAA受體介導的自發(fā)性抑制性突觸后電流[8]。近年來，研究表明催產素對多種神經系統(tǒng)疾病具有治療作用，如中風[9-10]及帕金森病[11]。由于神經系統(tǒng)發(fā)育分化的復雜性，神經環(huán)路的結構和功能在圍產期、幼年及成年盡管相互關聯(lián)，但又有各自不同的特點。目前催產素在新生動物缺氧缺血性損傷中的作用尚不明確。本研究探討了催產素對新生大鼠海馬CA1區(qū)神經元缺氧缺血性損傷的保護作用并揭示了其細胞機制，為催產素用于臨床治療NHIE提供理論基礎。

材 料 和 方 法

1 動物及分組

本研究的動物實驗嚴格按照《南昌大學實驗動物管理辦法》和《南昌大學動物實驗倫理審查》原則進行。健康7～10 d 齡Sprague-Dawley(SD)大鼠，雌雄不限，由江西中醫(yī)藥大學動物中心提供。取8只新生大鼠的海馬腦片(6～8片/只)，隨機分為4個處理組：對照(control)組、氧糖剝奪(oxygen-glucose deprivation，OGD) 20 min組、OGD 40 min組和OGD+oxytocin組。OGD 20 min組和OGD+oxytocin組孵育時間為20 min，OGD 40 min組孵育時間為40 min。全細胞膜片鉗記錄另取20只新生大鼠隨機分為4組，即OGD組、OGD+oxytocin組、OGD+dVOT(催產素受體阻斷劑)+oxytocin組和OGD+bicuculline(GABAA受體阻斷劑)+oxytocin組。

2 溶液及試劑

解剖液(即蔗糖高滲人工腦脊液，sucrose-substituted artificial cerebrospinal fluid，s-ACSF)成分為 (mmol/L)：240 sucrose、2.5 KCl、3.5 MgCl2、0.5 CaCl2、1.25 NaH2PO4、0.4 ascorbic acid、2 pyruvate和25 NaHCO3；人工腦脊液(artificial cerebrospinal fluid，ACSF)成分為 (mmol/L)：117 NaCl、3.6 KCl、1.2 NaH2PO4·2H2O、2.5 CaCl2·2H2O、1.2 MgCl2·6H2O、25 NaHCO3和11 glucose，pH 7.4；鉀電極內液成分為(mmol/L)：130 K-gluconate、5 KCl、4 Mg-ATP、10 phosphocreatinine、0.5 EGTA、0.3 Li-GTP和10 HEPES，pH 7.3，300 mOsm。催產素(1 μmol/L)、哇巴因(500 μmol/L)和bicuculline(10 μmol/L)購自Sigma；dVOT(1 μmol/L) 購自Bachem；TO-PRO-3 (1∶2 000)購自Invitrogen。

3 方法

3.1腦片制備 選取7～10 d 齡SD大鼠置于0 ℃冰水混合物中冰凍麻醉，采用2～4 ℃預充氧(95% O2+5% CO2)的解剖液行心臟灌流后將大鼠斷頭。用VT1000S震動切片機(Leica)進行350 μm厚度的腦冠狀切片，后將切片移入32 ℃持續(xù)充氧(95% O2+5% CO2)的ACSF中孵育1 h后移入記錄槽。

3.2制備體外缺血缺氧模型 OGD液是目前應用最普遍的用于模擬體外缺氧缺血的液體，其制備方法是將正常ACSF中的葡萄糖用相同摩爾質量的蔗糖代替，并充混合氣(95% N2+5% CO2)30 min以排盡溶液中的氧氣。在記錄細胞的缺氧去極化(anoxic depolarization，AD)時間時，為加速細胞死亡，于OGD液中加入鈉-鉀泵抑制劑哇巴因以誘導缺氧缺血所引起的細胞死亡[12]。

3.3TO-PRO-3染色 上述制備的腦片于ACSF液中恢復1 h后，將分好組的腦片放入上述4種溶液中進行孵育(37 ℃)。隨后將其置于TO-PRO-3溶液中染色20 min(室溫)，用ACSF洗去殘余染液。將腦片置于LSM700激光共聚焦顯微鏡(Zeiss)下觀察，激發(fā)光波長為639 nm，拍照時各參數(shù)保持一致。用ZEN2010軟件統(tǒng)計每個切片CA1區(qū)面積為500 μm×500 μm中TO-PRO-3熒光陽性神經元的數(shù)目。

3.4全細胞膜片鉗技術 在紅外相差顯微鏡下定位海馬CA1區(qū)椎體神經元。記錄電極(1.5 mm，1.12 mm ID； World Precision Instruments)由P-97電極拉制儀(Sutter Instrument)拉制而成，入液電阻為4～6 MΩ。灌流速度為1～3 mL/min。電流鉗模式下記錄缺氧去極化時間，鉗制電流為0 pA，所有記錄的神經元的靜息膜電位低于-45 mV，記錄溫度為32±1 ℃。信號采集采用EPC-10放大系統(tǒng)(HEAK)，分析數(shù)據(jù)用Clamp-Fit軟件。串聯(lián)電阻在20～30 MΩ之間，且在記錄過程中變化<20%。

4 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)分析用SPSS 17.0軟件。所有參數(shù)用均數(shù)±標準誤(mean±SEM)表示，n代表腦切片個數(shù)(TO-PRO-3染色實驗)或神經元個數(shù)(電生理實驗)。多組間比較采用單因素方差分析，事后檢驗采用 Bonferroni校正檢驗法。以P<0.05為有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 OGD對海馬神經元死亡的影響

為明確催產素的神經保護作用，我們采用TO-PRO-3染色方法標記死亡神經元，紅色熒光代表TO-PRO-3熒光所標記的死亡神經元。根據(jù)之前的研究[13-14]，我們選擇催產素濃度為1 μmol/L。結果顯示,OGD孵育20 min后，海馬CA1區(qū)TO-PRO-3陽性的神經元數(shù)目比對照組增加(P<0.01); OGD 40 min組與OGD 20 min組相比，神經元死亡數(shù)量增加差異無統(tǒng)計學意義,見圖1。這提示缺氧缺血后20 min神經元已發(fā)生嚴重的不可逆性死亡，因此在缺氧缺血早期對神經元進行保護是十分必要的，接下來的藥物實驗亦以此為時間點開展進一步研究。

Figure 1. The effect of OGD on the death of hippocampal neurons (TO-PRO-3 staining, ×20). DIC: differential interference contrast. Mean±SEM.n=14 in control group;n=9 in OGD 20 min group;n=10 in OGD 40 min group.**P<0.01vscontrol group.

圖1OGD對海馬神經元死亡的影響

2 催產素干預減少OGD所致的神經元死亡

在OGD液中加入催產素后，海馬CA1區(qū)TO-PRO-3陽性的神經元平均死亡數(shù)量比OGD 20 min組減少(P<0.01)，提示催產素可減少新生大鼠海馬CA1區(qū)神經元缺氧缺血后的死亡，具有神經保護作用，見圖2。

Figure 2. Oxytocin reduced the death of neurons caused by OGD (TO-PRO-3 staining). DIC: differential interference contrast. Mean±SEM.n=14 in control group;n=9 OGD 20 min group;n=10 OGD+oxytocin group.**P<0.01vscontrol group；##P<0.01vsOGD 20 min group.

圖2催產素干預減少OGD所致的神經元死亡

3 催產素顯著延長新生大鼠海馬神經元AD時間，其機制與GABAA受體介導的電流有關

為明確催產素對神經元缺氧缺血性損傷的保護作用機制，我們進一步觀察各組神經元AD出現(xiàn)的時間。如圖3所示，OGD組AD出現(xiàn)的時間是(13.44±1.84) min，相比OGD組，OGD+oxytocin組AD出現(xiàn)的時間延長至(23.19±2.04) min (P<0.01)，提示催產素可提高海馬神經元對缺氧缺血的耐受能力；OGD+dVOT+oxytocin組AD出現(xiàn)的時間是(15.49±1.74) min，相比OGD+oxytocin組，AD出現(xiàn)時間顯著縮短(P<0.05)；相比OGD+oxytocin組，OGD+bicuculline+oxytocin組的AD出現(xiàn)時間[(12.66±2.24) min]也明顯縮短(P<0.01)。以上結果提示，催產素對新生大鼠海馬神經元缺氧缺血性損傷具有拮抗作用，其作用可被dVOT和bicuculline所抑制，這表明催產素的神經保護作用是通過結合催產素受體所發(fā)揮，并且與GABAA受體介導的電流有關。

Figure 3. Oxytocin delayed the onset of anoxic depolarization (AD) of hippocampal CA1 pyramidal neurons. Below the traces, arrows indicated the appearance of AD. In this figure, a bar on top of the trace indicated the perfusion period unless noted elsewhere. A: representative recordings of the AD onset in OGD group (n=9); B: representative recordings of the AD onset in OGD+oxytocin group (n=9); C: representative recordings of the AD onset in OGD+dVOT+oxytocin group (n=11); D: representative recordings of the AD onset in OGD+bicuculline+oxytocin group (n=8); E: summary of the onset of anoxic AD under different conditions. Mean±SEM.*P<0.05,**P<0.01vsOGD+oxytocin group.

圖3催產素對新生大鼠海馬神經元缺氧去極化時間的影響

討 論

新生兒缺氧缺血性腦損傷發(fā)病機制復雜，其中興奮性毒性是導致神經元死亡的重要原因。缺氧缺血所產生的神經元興奮性毒性主要是由于興奮性神經遞質增強如谷氨酸大量釋放[4]以及抑制性神經遞質減弱如神經元丟失及GABA受體功能障礙[15]。本研究證實催產素可減少體外缺氧缺血所致的神經元死亡，其主要機制與催產素通過與神經元上催產素受體結合，增加抑制性傳遞，從而消除興奮性毒性有關。

本實驗TO-PRO-3染色結果表明，氧糖剝奪20 min導致新生大鼠海馬CA1區(qū)神經元死亡數(shù)量顯著增加，與之前報道[16]基本一致，提示在神經元缺氧缺血的早期采取有效的干預措施是十分有必要的。此外，我們的研究結果表明，催產素能顯著減少氧糖剝奪20 min導致的神經元死亡。

近年來，隨著對催產素的病理生理功能的深入研究，研究表明催產素對神經元損傷具有保護作用[9-10]，但機制仍然不明確。為進一步探討催產素的神經保護作用機制，我們研究了催產素對新生大鼠海馬神經元缺氧去極化時間的影響。缺氧去極化是電生理學上判斷神經元死亡的重要標志之一。由于缺氧去極化使神經元膜電位迅速去極化至0 mV，鉀離子大量外流及鈉離子和鈣離子內流，神經元和突觸功能發(fā)生不可逆性損傷[17]。因此，延長神經元缺氧去極化的時間，可為減少神經元的死亡贏得寶貴時間[18-19]。本研究結果顯示，催產素顯著延長了新生大鼠海馬椎體神經元缺氧去極化的時間，這與TO-PRO-3染色的結果一致。催產素受體在海馬CA1廣泛分布，如19%的GABA能神經元表達催產素受體，而80%以上的椎體神經元表達催產素受體[20]。我們觀察到催產素的保護作用可被催產素受體阻斷劑dVOT抑制，這表明催產素是通過結合的海馬神經元膜上的催產素受體產生保護作用。

在海馬中，催產素增強抑制性神經傳遞，其機制是調控抑制性中間神經元，促使GABA釋放增加，激活GABAA受體，增強突觸GABA介導的電流[8, 21]。抑制性神經傳遞如GABA可減少神經元缺氧缺血后谷氨酸的釋放，從而拮抗缺氧缺血所產生的興奮性毒性[22]，因此被認為是神經元缺氧缺血性損傷的保護機制之一。例如，地西泮、唑吡坦及氯鎂噻唑等GABA受體增強劑在動物實驗中被證實具有保護作用[6-7]。本研究表明，bicuculline阻斷GABAA受體后，催產素并不能延長AD出現(xiàn)的時間。因此，我們推測催產素的對新生大鼠的神經保護作用主要與GABAA受體介導的突觸后電流增強有關。Kaneko等[9]研究從分子生物上證實催產素調控GABAA受體亞基組成，增強GABAA受體效能，拮抗神經元的興奮性毒性，這與我們的研究具有相似性。而Ceanga等[13]和Tyzio等[14]的研究認為催產素可以降低胎鼠海馬神經元降低鈉-鉀-氯共同轉運體的活性，促進GABA受體轉變?yōu)橐种菩訹13-14]，我們認為這種結果的差異與實驗動物發(fā)育期不同有關。

綜上所述，催產素對新生大鼠海馬神經元缺氧缺血性損傷具有保護作用，其機制是通過結合催產素受體增強GABA能中間神經元的活動，使GABA釋放，拮抗神經元的興奮性毒性，提高催產素對缺氧缺血的耐受能力。我們的研究將為催產素用于新生兒缺氧缺血性腦病的治療提供新思路。

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