益氣化瘀化痰方對(duì)UUO誘導(dǎo)的腎間質(zhì)纖維化大鼠KLF15、HMGB1、NF-κB及其下游炎癥因子表達(dá)的影響*

張永越， 曹文富, △， 田 晟， 吳 慶

(重慶醫(yī)科大學(xué) 1附屬第一醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科， 2中醫(yī)藥學(xué)院， 重慶 400016)

腎間質(zhì)纖維化(renal interstitial fibrosis，RIF)是各種慢性腎臟病進(jìn)展至慢性腎衰竭(chronic renal failure，CRF)乃至終末期腎病(end-stage renal di-sease， ESRD)的主要病理基礎(chǔ)及共同轉(zhuǎn)歸。研究表明RIF起始于各種損傷引起的炎癥反應(yīng)[1]，高遷移率族盒蛋白1(high mobility group box protein 1，HMGB1)是介導(dǎo)損傷性炎癥反應(yīng)的主要因素。它通過(guò)信號(hào)級(jí)聯(lián)激活核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)[2]，繼而誘導(dǎo)單核細(xì)胞趨化蛋白1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)、白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)及腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)等炎性介質(zhì)的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)[3]，促進(jìn)腎臟炎性損傷，最終導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化。研究還表明鋅指蛋白超家族成員Krüppel樣因子15(Krüppel-like factor 15，KLF15)具有抗纖維化作用，可調(diào)控NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性[4]。目前對(duì)腎間質(zhì)纖維化的形成機(jī)制已有較深入的研究，但治療手段及療效仍較為有限。中藥多途徑、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)在腎間質(zhì)纖維化的防治中具有一定優(yōu)勢(shì)，但中醫(yī)典籍中并無(wú)“腎纖維化”的病名，根據(jù)其臨床表現(xiàn)及演變規(guī)律，類屬于“水腫”、“溺毒”、“癃閉”和“關(guān)格”等病癥，其病機(jī)主要為“氣虛、血瘀、痰凝及痰瘀互結(jié)”。本研究所用益氣化瘀化痰方(Yiqi Huayu Huatan decoction，YHHD)為曹文富教授治療慢性腎炎、腎病綜合征、IgA腎病、糖尿病腎病及腎功能不全的基礎(chǔ)方[5]。在前期研究和已知臨床療效的基礎(chǔ)上，本研究采用單側(cè)輸尿管結(jié)扎(unilateral ureteral obstruction，UUO)建立RIF大鼠模型，探討益氣化瘀化痰方改善腎間質(zhì)纖維化的作用機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雌性SD大鼠48只，體質(zhì)量180～220 g，購(gòu)買并飼養(yǎng)于重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物房，動(dòng)物許可證號(hào)為SYXK(渝)2012-0001。

1.2藥品及試劑 中藥飲片黃芪、白術(shù)、川芎、姜黃、瓜蔞和海藻購(gòu)于重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院中藥房(由重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥研究室曹文富教授鑒定合格)；替米沙坦(telmisartan)購(gòu)于重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院西藥房(國(guó)藥準(zhǔn)字H20080222；批號(hào)為6160616)；TRIzol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Premix購(gòu)自TaKaRa；PCR引物由成都寶生生物公司合成；兔抗鼠KLF15和MCP1多克隆抗體購(gòu)于Novus；兔抗鼠HMGB1單克隆抗體購(gòu)于Abcam；兔抗鼠NF-κB多克隆抗體購(gòu)于武漢塞維爾生物公司；HRP標(biāo)記羊抗兔IgG和HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG及β-actin單克隆抗體購(gòu)于EARTH；RIPA蛋白裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒和蛋白marker購(gòu)于碧云天生物技術(shù)公司；小鼠SP試劑盒和DAB顯色液購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)公司；ECL化學(xué)發(fā)光液購(gòu)于Affinity生物技術(shù)公司；大鼠胱抑素C(cystatin C，Cys-C)酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒和尿酸(uric acid，UA)檢測(cè)試劑盒(酶比色法)購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.3儀器設(shè)備 低溫高速離心機(jī)(Sigma)；Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件、ELISAcalc 計(jì)算軟件、T100TMPCR儀和Thermo NanoDrop 2000超微量核酸蛋白測(cè)定儀(上海基因有限公司)；AL204 型電子天平(METTLER TOLEDO)；CFX ConnectTM熒光定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)、電泳儀及電泳槽(Bio-Rad)；BX53熒光正置顯微鏡及CellSens Standard圖像采集軟件(OLYMPUS)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；4 ℃冰箱和-80 ℃超低溫冰箱(Haier公司)。

2 方法

2.1UUO模型的建立 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，禁食不禁水12 h后，用2%戊巴比妥鈉以2.5 mL/kg劑量腹腔注射。常規(guī)備皮、消毒、鋪巾，于左肋緣下脊柱旁開(kāi)1.5 cm處作2 cm左右切口，將左腎牽拉出切口，在腎蒂處脂肪內(nèi)沿左腎下極尋找輸尿管，齊左腎下極用4-0絲線結(jié)扎輸尿管，距結(jié)扎點(diǎn)0.7 cm處再次結(jié)扎，于兩結(jié)扎點(diǎn)間剪斷輸尿管，將左腎還納腹腔，依次縫合肌肉筋膜、皮膚，切口消毒。假手術(shù)組除不結(jié)扎剪斷輸尿管，其余操作相同。

2.2藥物制備 益氣化瘀化痰方各中藥飲片均按《中國(guó)藥典》(2015版)規(guī)定的臨床常用量使用，即黃芪30 g、白術(shù)10 g、川芎10 g、姜黃10 g、瓜蔞10 g和海藻10 g。各中藥飲片混合水提后，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮成含生藥2 kg/L的制劑，4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｌ婷咨程怪苿┯蒙睇}水配成2 g/L的制劑，現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.3分組及給藥 UUO術(shù)后將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、替米沙坦組及益氣化瘀化痰方低、中、高劑量(YHHD-low、YHHD-middle和YHHD-high)組，每組8只。根據(jù)《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》體表面積折算法計(jì)算大鼠用藥劑量，成人體重以70 kg算，大鼠等效劑量為成人6.3倍，由此算出大鼠替米沙坦和益氣化瘀化痰方的臨床等效劑量分別為3.6 mg/kg和7.2 g/kg。以臨床等效劑量的0.5倍、1倍及2倍設(shè)立益氣化瘀化痰方低(3.6 g/kg)、中(7.2 g/kg)和高(14.4 g/kg)劑量。術(shù)后各組大鼠予相應(yīng)制劑灌胃，制劑間的體積差用生理鹽水補(bǔ)齊，模型組和假手術(shù)組予等體積生理鹽水灌胃。各組大鼠分籠喂養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)期間每日灌胃1次，連續(xù)用藥12周，自由飲水、進(jìn)食相同的標(biāo)準(zhǔn)飼料。

2.4標(biāo)本采集 灌胃12周并于末次灌胃后，禁食不禁水12 h，用2%戊巴比妥鈉以2.5 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠，心臟取血，血清于-80 ℃保存，用于檢測(cè)血清胱抑素C和尿酸；取術(shù)側(cè)腎臟，部分腎組織放入液氮速凍后轉(zhuǎn)入-80 ℃保存，用于提取mRNA及蛋白，部分4%多聚甲醛固定。

2.5腎功能檢測(cè) 血清胱抑素C和尿酸檢測(cè)按試劑盒說(shuō)明書操作。

2.6腎組織形態(tài)學(xué)觀察 腎組織固定后，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，制成3 μm厚切片；按試劑說(shuō)明進(jìn)行PAS染色和Masson染色后，脫水，透明，中性樹(shù)膠封片。

2.7膠原面積計(jì)算 400倍光鏡下，每張切片隨機(jī)選擇10個(gè)不重疊視野，用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件測(cè)定其陽(yáng)性(藍(lán)色)區(qū)域面積與該視野組織的總面積(去除腎小管管腔)，以二者百分比計(jì)算腎間質(zhì)膠原纖維沉積率。

2.8Real-time PCR TRIzol法提取總mRNA，在37 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s條件下逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。擴(kuò)增條件為預(yù)變性 95 ℃ 30 s；95 ℃變性 5 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，循環(huán)40次。采用real-time PCR相對(duì)定量方法(2-ΔΔCt法)進(jìn)行分析。引物信息見(jiàn)表1。

2.9Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) RIPA裂解液提取腎組織總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，用5×上樣緩沖液配平各蛋白樣品，上樣進(jìn)行SDS-PAGE。根據(jù)蛋白marker位置切下目的蛋白所在的PAGE膠；將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜后，用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h。加 I 抗，搖床4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜3次，每次5 min。室溫下 II 抗孵育1 h，TBST洗膜3次，每次5 min?；瘜W(xué)發(fā)光成像儀中顯影。目的蛋白與內(nèi)參照β-actin吸光度值之比為該蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2.10免疫組化檢測(cè)MCP-1蛋白表達(dá) 采用SP法，石蠟切片常規(guī)脫蠟至水；枸櫞酸鈉微波加熱法修復(fù)抗原；3%過(guò)氧化氫孵育消除過(guò)氧化物酶活性；山羊血清封閉。滴加抗MCP-1抗體，濕盒4 ℃過(guò)夜；滴加生物素標(biāo)記 II 抗孵育；滴加HRP標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液孵育；DAB避光顯色。蘇木素復(fù)染，自來(lái)水沖洗，脫水，透明，封片。400倍鏡下每張切片隨機(jī)選取10個(gè)不重疊視野，使用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件，分別計(jì)算陽(yáng)性區(qū)域積分吸光度(integrated absorbance，IA)及視野內(nèi)組織面積(area)，以平均吸光度(IA/area)作為該蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

表1 Real-time PCR的引物序列

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。Levene檢驗(yàn)判斷方差齊性，方差齊時(shí)組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用SNK-q檢驗(yàn)；方差不齊時(shí)采用獨(dú)立樣本Kruskal-Wallis檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 腎組織外觀

假手術(shù)組腎臟大小形態(tài)正常，呈暗紅色、質(zhì)軟；模型組左側(cè)腎臟明顯腫大，呈暗褐色，包膜緊張，切開(kāi)后內(nèi)含褐色渾濁腎積水，腎盂腎盞擴(kuò)張變形；YHHD中、高劑量組及替米沙坦組左側(cè)腎臟亦明顯腫大、呈暗褐色，但殘存皮質(zhì)較模型組厚。

2 腎組織形態(tài)學(xué)觀察

PAS和Masson染色結(jié)果顯示假手術(shù)組腎組織結(jié)構(gòu)正常，僅腎小球基膜、系膜區(qū)及小管周圍間質(zhì)區(qū)見(jiàn)少量膠原纖維呈線狀分布；模型組腎小球數(shù)量減少，腎小管嚴(yán)重萎縮，炎性細(xì)胞彌漫浸潤(rùn)，腎間質(zhì)區(qū)及系膜區(qū)增寬伴大量膠原纖維沉積；各藥物干預(yù)組較模型組間質(zhì)纖維化程度有所減輕，其中YHHD中、高劑量組及替米沙坦組改善較明顯，見(jiàn)圖1、2。

3 YHHD對(duì)膠原纖維沉積率的影響

Masson染色后計(jì)算腎間質(zhì)膠原纖維沉積率。結(jié)果顯示，模型組膠原纖維沉積率明顯高于假手術(shù)組(P<0.05)；YHHD中、高劑量組及替米沙坦組明顯低于模型組(P<0.05)；YHHD低劑量組與模型組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見(jiàn)表2。

Figure 1. The morphological changes of renal tissues in the rats of each group (PAS staining，×400). A: sham group； B:model group；C: telmisartan group； D: YHHD-low group； E: YHHD-middle group； F: YHHD-high group.

圖1各組大鼠腎組織腎組織形態(tài)變化

Figure 2. The collagen deposition in renal tissues of the rats in each group (Masson staining，×400). A: sham group； B: model group； C: telmisartan group； D: YHHD-low group； E: YHHD-middle group； F: YHHD-high group.

圖2各組大鼠腎組織膠原沉積情況

4 YHHD對(duì)血清胱抑素C和尿酸的影響

Cys-C是評(píng)價(jià)腎功能損害的靈敏標(biāo)志物。本研究中模型組血清Cys-C較假手術(shù)組顯著升高(P<0.05)；YHHD低、中、高劑量組及替米沙坦組Cys-C較模型組均顯著下降(P<0.05)。各組間UA水平的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見(jiàn)表2。

表2各組大鼠血清Cys-C、UA和腎組織膠原纖維沉積率的比較

Table 2. Comparison of serum levels of Cys-C and UA, and the deposition rate of collagen fibers in renal tissues of the rats in each group (Mean±SD.n=8)

GroupCys?C(mg/L)UA(μmol/L)DepositionrateofcollagenfibersSham3．37±0．1128．27±9．070．044±0．010Model12．76±0．58#31．77±7．360．472±0．106#Telmisartan5．17±0．75?#30．80±2．880．232±0．128?#YHHD?low6．31±0．84?#29．82±5．000．387±0．129#YHHD?middle5．32±0．65?#30．02±8．280．275±0．103?#YHHD?high4．61±0．43?#31．77±9．330．207±0．100?#

#P<0.05vssham group；*P<0.05vsmodel group.

5 YHHD對(duì)腎間質(zhì)纖維化相關(guān)基因表達(dá)的影響

模型組中HMGB1、NF-κB、 IκB、MCP-1、IL-1β和TNF-α的mRNA表達(dá)較假手術(shù)組明顯上調(diào)(P<0.05)，藥物干預(yù)后上述基因表達(dá)較模型組均有不同程度下調(diào)，以YHHD高劑量組下調(diào)最明顯(P<0.05)。檢測(cè)細(xì)胞外基質(zhì)成分的基因表達(dá)發(fā)現(xiàn)，模型組的纖連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)、I 型膠原(collagen type I ，Col I) 和IV型膠原(collagen type IV，Col IV)的mRNA表達(dá)較假手術(shù)組明顯上調(diào)(P<0.05)，藥物干預(yù)后，YHHD高劑量組下調(diào)最明顯(P<0.05)，其次為替米沙坦組。模型組及各藥物干預(yù)組抗纖維化因子KLF15的mRNA水平均較假手術(shù)組明顯下調(diào)(P<0.05)，但YHHD高劑量組較模型組有明顯上調(diào)(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

6 YHHD對(duì)腎組織HMGB1、NF-κB和KLF15蛋白表達(dá)的影響

模型組的HMGB1和NF-κB的蛋白表達(dá)較假手術(shù)組明顯上調(diào)(P<0.05)，KLF15的蛋白表達(dá)較假手術(shù)組明顯下調(diào)(P<0.05)；YHHD中、高劑量組及替米沙坦組的HMGB1和NF-κB表達(dá)較模型組明顯下調(diào)(P<0.05)，YHHD高劑量組及替米沙坦組的KLF15表達(dá)較模型組明顯上調(diào)(P<0.05)，見(jiàn)圖4、表3。

7 免疫組化檢測(cè)腎組織MCP-1蛋白的表達(dá)

假手術(shù)組MCP-1僅微量表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞；模型組MCP-1大量表達(dá)于腎小球內(nèi)皮細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞及間質(zhì)區(qū)，在纖維化和炎細(xì)胞浸潤(rùn)區(qū)表達(dá)明顯增強(qiáng)；YHHD高劑量組和替米沙坦組MCP-1少量表達(dá)于間質(zhì)區(qū)；YHHD低、中劑量組MCP-1表達(dá)區(qū)域與模型組大致相同，但表達(dá)量和強(qiáng)度均低于模型組，見(jiàn)圖5。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，模型組的MCP-1表達(dá)明顯高于假手術(shù)組(P<0.05)，YHHD高劑量組和替米沙坦組MCP-1表達(dá)明顯低于模型組(P<0.05)，而YHHD低、中劑量組MCP-1表達(dá)水平與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見(jiàn)表3。

Figure 3. The expression of fibrosis-related genes in renal tissues of the rats in each group. Mean±SD.n=8.#P<0.05vssham group；*P<0.05vsmodel group.

圖3各組大鼠腎組織纖維化相關(guān)基因的表達(dá)

Figure 4. The protein expression of HMGB1, NF-κB and KLF15 in renal tissues of the rats in each group.

圖4各組大鼠腎組織HMGB1、NF-κB和KLF15蛋白的表達(dá)

討 論

腎纖維化包括RIF和腎小球硬化。RIF程度與腎功能受損程度具有高度相關(guān)性，決定慢性腎臟病的預(yù)后[6]。本研究采用單側(cè)輸尿管結(jié)扎建立腎間質(zhì)纖維化模型，該模型是觀察RIF的經(jīng)典模型，在研究中被廣泛應(yīng)用[7]。

本研究所用益氣化瘀化痰方中黃芪為“益氣補(bǔ)中要藥”，白術(shù)為“益氣健脾要藥”；川芎為“血中之氣藥”，姜黃“主心腹結(jié)積，下氣，破血，消癰腫”；海藻“主破散結(jié)氣，癰腫癥瘕堅(jiān)氣”，瓜蔞“滌痰結(jié)，止消渴，利大腸消癰腫瘡毒”。益氣藥黃芪、白術(shù)與化痰藥瓜蔞、海藻配伍，能協(xié)同發(fā)揮益氣健脾、化痰散結(jié)作用，再與化瘀藥川芎、姜黃配伍，共奏益氣化瘀化痰之效。益氣扶正使津液正常輸布、血脈通利，杜絕痰濁與瘀血的生成；化瘀化痰促進(jìn)已成之“痰凝、瘀血”消散，諸藥合用以期改善腎間質(zhì)纖維化“痰濁凝聚、痰瘀互結(jié)”的病理狀態(tài)，在一定程度上恢復(fù)腎組織結(jié)構(gòu)及功能。已有研究表明上述中藥或其有效成分可通過(guò)多種途徑調(diào)節(jié)參與纖維化進(jìn)程的關(guān)鍵因子，發(fā)揮抗纖維化作用[8-11]。

Figure 5. The protein expression of MCP-1 in renal tissues of the rats in each group (immunohistochemical staining，×400). A: sham group； B: model group； C: telmisartan group； D: YHHD-low group； E: YHHD-middle group； F: YHHD-high group.

圖5各組大鼠腎組織MCP-1蛋白的表達(dá)

表3各組大鼠腎組織HMGB1、NF-κB、KLF15及MCP-1蛋白的表達(dá)

Table 3. The protein expression of HMGB1, NF-κB, KLF15 and MCP-1 in renal tissues of the rats in each group (Mean±SD.n=8)

GroupHMGB1NF?κBKLF15MCP?1Sham1．930±0．3880．366±0．0503．833±0．2600．003±0．002Model4．056±0．518#1．096±0．102#1．870±0．325#0．270±0．202#Telmisartan2．440±0．299?#0．457±0．134?#2．462±0．584?#0．013±0．006?YHHD?low4．030±0．505#1．034±0．085#1．828±0．380#0．068±0．025#YHHD?middle3．399±0．509?#0．831±0．121?#2．348±0．378#0．043±0．022#YHHD?high1．291±0．255?#0．357±0．078?2．643±0．265?#0．009±0．006?

*P<0.05vsmodel group;#P<0.05vssham group.

Cys-C是評(píng)價(jià)腎功能損害的敏感指標(biāo)[12]。本研究中模型組Cys-C明顯升高，PAS及Masson染色顯示腎小管萎縮，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，間質(zhì)大量膠原纖維沉積，纖維化明顯。藥物干預(yù)后，各組Cys-C均較模型組明顯下降，腎小管萎縮及間質(zhì)纖維化較模型組明顯減輕，以YHHD高劑量組改善最為明顯。

腎間質(zhì)纖維化始于各種病因引起的腎組織損傷，持續(xù)存在的損傷使炎癥反應(yīng)失去控制，引發(fā)病理性修復(fù)，繼而導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化[13]。UUO引起的炎癥反應(yīng)由機(jī)械損傷所致，損傷相關(guān)分子模式(da-mage-associated molecular patterns，DAMPs)是促成這種非感染性炎癥的主要因素。HMGB1是存在于真核細(xì)胞核內(nèi)的非組蛋白染色體結(jié)合蛋白，也是近年來(lái)研究較多的內(nèi)源性DAMP[14]。組織損傷、細(xì)胞壞死或固有免疫細(xì)胞被激活時(shí)，釋放到細(xì)胞外的HMGB1成為一種“內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào)”，與單核巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞等天然免疫細(xì)胞表面的模式識(shí)別受體結(jié)合[15]，通過(guò)受體胞內(nèi)區(qū)的髓樣分化因子88，激活I(lǐng)L-1受體連接的蛋白激酶和腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6，繼而激活I(lǐng)κB激酶IKK，使NF-κB的抑制因子IκB降解，NF-κB得以轉(zhuǎn)位入核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活功能。NF-κB對(duì)多種參與炎癥過(guò)程的酶類、細(xì)胞因子以及細(xì)胞黏附分子的表達(dá)都起到重要調(diào)節(jié)作用，可引起其下游MCP-1、IL-1β和TNF-α等炎癥介質(zhì)的過(guò)度表達(dá)[16]。MCP-1為CC亞家族趨化因子，對(duì)單核巨噬細(xì)胞在內(nèi)的多種炎細(xì)胞具有趨化和激活作用，而浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞數(shù)與腎間質(zhì)纖維化程度成正比[17]。此外，過(guò)度表達(dá)的IL-1β和TNF-α又可刺激單核巨噬細(xì)胞釋放HMGB1，活化NF-κB，致炎癥信號(hào)不斷放大，造成炎癥失控遷延，進(jìn)一步加重腎組織損傷[18-19]。

KLF15主要在腎臟的系膜細(xì)胞區(qū)和腎間質(zhì)區(qū)表達(dá)，具有調(diào)控分化，增殖，凋亡和纖維化等作用[20]。研究表明KLF15可與NF-κB的p65亞基競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合乙酰基轉(zhuǎn)移酶p300，抑制p300依賴的p65乙酰化(p65乙?；荖F-κB發(fā)揮轉(zhuǎn)錄活性的重要翻譯后修飾方式)，從而減少NF-κB下游炎癥介質(zhì)合成，發(fā)揮抗炎、抗纖維化作用[4]。

本研究中模型組HMGB1表達(dá)較假手術(shù)組顯著上調(diào)，而HMGB1由損傷細(xì)胞及固有免疫細(xì)胞釋放，提示UUO后的輸尿管梗阻導(dǎo)致腎組織持續(xù)損傷及免疫細(xì)胞激活。藥物干預(yù)后各組HMGB1表達(dá)均有下調(diào)，以YHHD高劑量組下調(diào)最明顯。釋放到胞外的HMGB1可通過(guò)各級(jí)信號(hào)級(jí)聯(lián)激活NF-κB，控制其下游MCP-1、IL-1β及TNF-α等多種炎癥介質(zhì)的表達(dá)。本研究中模型組NF-κB表達(dá)較假手術(shù)組明顯上調(diào)，各藥物干預(yù)后NF-κB表達(dá)顯著下調(diào)，同樣以YHHD高劑量組下調(diào)最明顯。相應(yīng)的，模型組MCP-1、IL-1β及TNF-α 較假手術(shù)組明顯上調(diào)，藥物干預(yù)后，仍以YHHD高劑量組下調(diào)最明顯。以上結(jié)果提示單側(cè)輸尿管結(jié)扎后存在炎癥信號(hào)級(jí)聯(lián)激活，炎癥因子及趨化因子表達(dá)顯著上調(diào)，腎組織發(fā)生了明顯的炎癥反應(yīng)。而益氣化瘀化痰方能下調(diào)上述各因子的表達(dá)，減輕UUO腎組織的炎癥反應(yīng)。其機(jī)制可能與減少損傷細(xì)胞及免疫細(xì)胞釋放HMGB1，抑制NF-κB激活有關(guān)。IκB為NF-κB的抑制蛋白，無(wú)胞外信號(hào)刺激時(shí)，與NF-κB的P50/P65亞基結(jié)合形成三聚體非活性形式[21]。但本研究中IκB的表達(dá)與NF-κB一致，即模型組二者表達(dá)明顯上調(diào)，YHHD高劑量組表達(dá)明顯下調(diào)。因此我們推測(cè)NF-κB與IκB的表達(dá)存在對(duì)應(yīng)關(guān)系，YHHD干預(yù)并不能直接影響IκB的表達(dá)。

KLF15最初在心肌肥厚、心肌纖維化中被研究得較多，它能減輕心肌間質(zhì)纖維化、抑制心肌成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變[22]。近年來(lái)一些研究發(fā)現(xiàn)在UUO和5/6 腎切除大鼠模型中，KLF 15表達(dá)均出現(xiàn)明顯下降，Klf15-/-小鼠也更容易出現(xiàn)心、腎纖維化[23-24]。以上研究均提示KLF15參與并調(diào)控纖維化的發(fā)生和發(fā)展。本研究中模型組及各藥物干預(yù)組的KLF15 表達(dá)較假手術(shù)組顯著降低，與報(bào)道一致。藥物干預(yù)后，YHHD高劑量組的KLF15 表達(dá)則較模型組明顯上調(diào)。

細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)成分是構(gòu)成組織、器官結(jié)構(gòu)的基本框架，其在病理性修復(fù)中異常增多、過(guò)度沉積是纖維化的主要表現(xiàn)。ECM成分中的Col I為間質(zhì)性或纖維性膠原，含量較高；Col Ⅳ為非纖維性或無(wú)定型膠原，主要存在于基底膜及腎間質(zhì)[25]；FN可結(jié)合纖維素、膠原及細(xì)胞受體，在ECM 的產(chǎn)生、沉積中發(fā)揮重要作用[26]。本研究中模型組腎組織Col I、Col Ⅳ及FN較假手術(shù)組顯著上調(diào)，提示ECM 成分大量合成，與Masson染色顯示的纖維沉積相符。藥物干預(yù)后，各組Col I、Col Ⅳ及FN 表達(dá)均有不同程度下調(diào)，其中YHHD高劑量組下調(diào)最明顯，提示益氣化瘀化痰方能減少ECM 合成，減輕腎間質(zhì)纖維化。

隨著研究進(jìn)展，人們逐漸認(rèn)識(shí)到中藥在治療腫瘤、心血管病及器官纖維化等復(fù)雜疾病中的優(yōu)勢(shì)。RIF的發(fā)生發(fā)展不僅僅是單個(gè)靶點(diǎn)改變，常涉及多個(gè)靶點(diǎn)失衡、多條信號(hào)通路的交互作用[27]。近年來(lái)，針對(duì)多途徑、多靶點(diǎn)的復(fù)方藥物研究成為腎纖維化治療中的研究對(duì)象[6]。本研究證實(shí)所選用的益氣化瘀化痰方呈劑量依賴性地下調(diào)炎癥相關(guān)的HMGB1、NF-κB、MCP-1、IL-1β、TNF-α 表達(dá)，上調(diào)抗纖維化因子KLF15 的表達(dá)，從而減少ECM 成分Col I、Col Ⅳ及FN 的合成，減輕腎間質(zhì)纖維化、改善腎功能，且益氣化瘀化痰方高劑量組上述作用略優(yōu)于替米沙坦。其具體機(jī)制一方面可能是通過(guò)減少HMGB1的釋放以抑制NF-κB核轉(zhuǎn)位；另一方面是通過(guò)上調(diào)KLF15表達(dá)以競(jìng)爭(zhēng)抑制NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性。這2種方式均能減少NF-κB及其下游炎癥因子、趨化因子等炎性介質(zhì)的表達(dá)，抑制腎間質(zhì)炎癥反應(yīng)，從而減輕腎間質(zhì)纖維化。

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