RELMα/FIZZ1信號(hào)通路對(duì)血管新生影響的細(xì)胞學(xué)研究*

儲(chǔ) 新， 李 彤， 楊永曜

(1貴州醫(yī)科大學(xué)附屬人民醫(yī)院心內(nèi)科, 2貴州省人民醫(yī)院消化內(nèi)鏡科， 3貴州省人民醫(yī)院心內(nèi)科， 貴州 貴陽(yáng) 550000)

近年來(lái)，易損血管(vulnerable vessel)，即 “易于出現(xiàn)血管內(nèi)皮損傷、脂質(zhì)浸潤(rùn)和血管壁炎癥，動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生和發(fā)展迅速，進(jìn)而導(dǎo)致心肌缺血癥狀或發(fā)展成為易損斑塊的血管”的概念提出后，易損血管中斑塊不穩(wěn)定及不良血管功能導(dǎo)致的心、腦血管事件，如心肌梗塞和腦卒中等已成為全球的主要死因[1-2]，日益受到重視。因此，尋找新的治療靶點(diǎn)，改善易損血管中易損斑塊的成份及血管舒縮功能，使其向穩(wěn)定性斑塊方向逆轉(zhuǎn)，成為防治急性心血管事件的重要內(nèi)容。FIZZ1屬于抵抗素(resistin)樣分子家族成員，因此又命名為抵抗素樣分子α(resistin-like molecule α，RELMα)，在選擇性激活的巨噬細(xì)胞、缺氧的肺血管壁和炎癥的肉芽組織中均有表達(dá)，具有促增殖、血管收縮、血管新生和類(lèi)趨化因子的作用。Chen等[3]研究提示FIZZ1通過(guò)激活Raf-ERK1/2-p38 MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路收縮氣道平滑肌，而RELMα/FIZZ1 與動(dòng)脈粥樣硬化血管新生的關(guān)系及其機(jī)制報(bào)道甚少，因此，本文探討RELMα/FIZZ1對(duì)易損的小鼠主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞MOVAS及小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(mouse aortic endothelial cell,MAEC)的血管生成的影響及其相關(guān)機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 材料

MAEC和MOVAS細(xì)胞購(gòu)自廣州吉妮歐生物科技有限公司；胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco；聚凝胺(polybrene)購(gòu)自上海吉?jiǎng)P制藥技術(shù)有限公司；兔抗鼠FIZZ1(RELMα)、鈣調(diào)蛋白(calmodulin，CaM)和肌球蛋白輕鏈激酶(myosin light chain kinase，MLCK)抗體購(gòu)自Abcam；辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG購(gòu)自博士德公司；pGSadeno-HK、pGSadeno-RELMα/FIZZ1、pGSadeno-shRNA control和pGSadeno-shRNA RELMα/FIZZ1腺病毒表達(dá)載體均由美國(guó)約翰霍普金斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院Angelini教授惠贈(zèng)；Ca2+檢測(cè)試劑盒購(gòu)自凱基公司；Matirgel購(gòu)自Corning；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和real-time PCR 試劑盒購(gòu)自TaKaRa；FIZZ1(RELMα)、CaM和MLCK引物均由上海吉?jiǎng)P制藥技術(shù)有限公司合成。

2 方法

2.1腺病毒感染細(xì)胞 通過(guò)免疫熒光法對(duì)2種細(xì)胞進(jìn)行鑒定，其中MAEC以vWF抗體免疫熒光進(jìn)行鑒定，MOVAS細(xì)胞以α-SMA免疫熒光進(jìn)行鑒定。2株細(xì)胞均培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，消化收集細(xì)胞，按照每孔4×105個(gè)接種于6孔培養(yǎng)板，生長(zhǎng)至80%左右時(shí)，將腺病毒液加入培養(yǎng)的細(xì)胞中，并加入5 mg/L的polybrene進(jìn)行病毒感染；同時(shí)取未感染細(xì)胞作為對(duì)照(control)組，混勻、過(guò)夜感染后換成正常的完全培養(yǎng)基。感染72 h后觀察熒光，判斷感染效率，并檢測(cè) FIZZ1/RELMα蛋白的表達(dá)。

2.2MTT實(shí)驗(yàn)和活細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力 腺病毒分別感染MAEC 和MOVAS細(xì)胞，培養(yǎng)72 h后將各組細(xì)胞接種于96孔板，每孔接種3×103個(gè)細(xì)胞， 5% CO2、37 ℃培養(yǎng)0、24、48和72 h，設(shè)3個(gè)復(fù)孔，收集各個(gè)時(shí)點(diǎn)細(xì)胞，每孔加入 20 μL 5 g/L MTT檢測(cè)試劑，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h，檢測(cè)波長(zhǎng)490 nm處各孔的吸光度(A)，同時(shí)通過(guò)人工計(jì)數(shù)的方法檢測(cè)各時(shí)點(diǎn)活細(xì)胞數(shù)，以103為數(shù)量級(jí)計(jì)數(shù)。

2.3MAEC基質(zhì)膠管腔形成的觀察 96孔板中每孔加人50 μL Matrigel，輕輕搖晃培養(yǎng)板使其鋪平于孔內(nèi)，37 ℃放置2 h，使Matrigel凝固。MAEC感染腺病毒，培養(yǎng)72 h后，收集細(xì)胞，每孔加入1×104個(gè)細(xì)胞，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h，倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞的管腔形成情況。在特定的時(shí)點(diǎn)采集圖片，并且進(jìn)行圖像分析(Wimasis全自動(dòng)分析軟件)，統(tǒng)計(jì)成環(huán)數(shù)、細(xì)胞覆蓋面積和結(jié)點(diǎn)。

2.4MOVAS細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度變化的檢測(cè) 腺病毒感染MOVAS細(xì)胞72 h后，用胰酶將細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液，加入離心管中，1 000 r/min 離心5 min，棄上清；用1×PBS重懸細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清；用1 mL 1×PBS重懸細(xì)胞；加入5 μmol/L Fluo-3 AM-DMSO，混勻，置入37 ℃水浴箱中避光孵育30 min；1 000 r/min離心5 min，棄上清，1×PBS洗滌2次， 1 mL 1×PBS重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度。

2.5Western blot檢測(cè)MOVAS細(xì)胞內(nèi)CaM與MLCK蛋白的表達(dá) 腺病毒感染MOVAS細(xì)胞，培養(yǎng)72 h后，消化收集細(xì)胞，用細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法檢測(cè)總蛋白濃度，蛋白經(jīng)溴酚藍(lán)處理后進(jìn)行SDS-PAGE，上樣量為20 μg，濃縮膠60 V電泳60 min，分離膠120 V電泳70 min，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜100 V 60 min，5% BSA封閉60 min用相應(yīng)的I抗(根據(jù)說(shuō)明書(shū)稀釋)4 ℃孵育過(guò)夜，后加入II抗(羊抗兔IgG, 1∶5 000)室溫孵育1 h。ECL化學(xué)發(fā)光，X線底片顯影。

2.6Real-time PCR檢測(cè)MOVAS細(xì)胞內(nèi)CaM與MLCK的mRNA表達(dá) 腺病毒感染培養(yǎng)72 h后，棄去原培養(yǎng)基，使用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞；TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，以提取的總RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)體系為70 ℃保溫10 min后迅速在冰上冷卻2 min、42 ℃ 60 min、72℃ 15 min。按照Real-Time PCR試劑盒(RR420A)進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增 40 個(gè)循環(huán)周期，每個(gè)標(biāo)本3個(gè)復(fù)孔。檢測(cè)CaM和MLCK的mRNA相對(duì)表達(dá)量。引物序列見(jiàn)表1。

表1 Real-time PCR引物序列

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK法，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 腺病毒感染細(xì)胞的鑒定結(jié)果

MAEC 和MOVAS 細(xì)胞感染腺病毒，其感染效率較高，Western blot檢測(cè)顯示過(guò)表達(dá)RELMα/FIZZ1組中RELMα/FIZZ1蛋白表達(dá)顯著升高，而干擾組中RELMα/FIZZ1蛋白表達(dá)顯著減低(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

2 MTT法檢測(cè)RELMα/FIZZ1對(duì)MAEC和MOVAS細(xì)胞增殖能力的影響

細(xì)胞活力檢測(cè)結(jié)果表明，以MAEC為研究對(duì)象，過(guò)表達(dá)RELMα/FIZZ1可顯著提高細(xì)胞活力，而干擾RELMα/FIZZ1的表達(dá)則顯著抑制細(xì)胞活力(P<0.05)；以MOVAS細(xì)胞為研究對(duì)象，過(guò)表達(dá)RELMα/FIZZ1可顯著提高細(xì)胞活力，而干擾RELMα/FIZZ1的表達(dá)則顯著抑制細(xì)胞活力(P<0.05)；顯示過(guò)表達(dá)RELMα/FIZZ1可促進(jìn)MAEC和MOVAS的生長(zhǎng)，干擾 RELMα/FIZZ1抑制MAEC和MOVAS的生長(zhǎng)，見(jiàn)表2?；罴?xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果與MTT法檢測(cè)結(jié)果趨勢(shì)相同，隨實(shí)驗(yàn)進(jìn)行，與過(guò)照組比較， RELMα/FIZZ1過(guò)表達(dá)組活細(xì)胞數(shù)量顯著升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而干擾RELMα/FIZZ1則活細(xì)胞數(shù)量升高受抑制(P<0.05)，顯示過(guò)表達(dá)RELMα/FIZZ1可促進(jìn)MAEC和MOVAS細(xì)胞的增殖，干擾 RELMα/FIZZ1抑制MAEC和MOVAS細(xì)胞的生長(zhǎng)，見(jiàn)表3。

3 MAEC管腔形成的觀察

管腔形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果示，與對(duì)照組比較，過(guò)表達(dá)RELMα/FIZZ1使MAEC管腔形成數(shù)目顯著增加，而干擾RELMα/FIZZ1的表達(dá)，MAEC管腔形成數(shù)顯著減少(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

4 MOVAS細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的變化

各組細(xì)胞內(nèi)Ca2+平均熒光強(qiáng)度結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，RELMα/FIZZ1過(guò)表達(dá)可顯著提高M(jìn)OVAS細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，而干擾RELMα/FIZZ1則細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

5 RELMα/FIZZ1對(duì)MOVAS細(xì)胞內(nèi)CaM與MLCK蛋白表達(dá)的影響

過(guò)表達(dá)RELMα/FIZZ1上調(diào)MOVAS的CaM與MLCK表達(dá)(P<0.05)；干擾RELMα/FIZZ1抑制MOVAS的CaM與MLCK表達(dá)(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

6 RELMα/FIZZ1對(duì)MOVAS細(xì)胞內(nèi)CaM與MLCK mRNA表達(dá)的影響

過(guò)表達(dá)RELMα/FIZZ1上調(diào)MOVAS胞內(nèi)CaM與MLCK的mRNA表達(dá)(P<0.05)；干擾RELMα/FIZZ1抑制MOVAS胞內(nèi)CaM與MLCK的mRNA表達(dá)(P<0.05)，見(jiàn)圖5。

Figure 1. The cell infection rate and the results of Western blot detection in the cells infected with adenovirus for 72 h. Mean±SD.n=3.*P<0.05vspGSadeno-HK group；#P<0.05vspGSadeno-shRNA control group.

圖1腺病毒感染72h細(xì)胞感染率與Westernblot檢測(cè)結(jié)果的比較

表2MTT法檢測(cè)感染腺病毒后MAEC和MOVAS細(xì)胞活力的變化

Table 2. MTT assay was used to detect the viability of the MAEC and MOVAS cells infected with adenovirus (A490value. Mean±SD.n=3)

CellsGroup0h24h48h72hMAECpGSadeno?HK0．348±0．0030．417±0．0041．040±0．0151．347±0．023pGSadeno?RELMα/FIZZ10．354±0．0060．538±0．006?1．286±0．016?1．743±0．011?pGSadeno?shRNAcontrol0．349±0．0020．428±0．0051．084±0．0391．348±0．017pGSadeno?shRELMα/FIZZ10．341±0．0020．396±0．0060．818±0．005#0．99±0．011#MOVASpGSadeno?HK0．359±0．0020．437±0．0050．942±0．0101．278±0．023pGSadeno?RELMα/FIZZ10．355±0．0030．502±0．005?1．187±0．013?1．538±0．008?pGSadeno?shRNAcontrol0．367±0．0050．448±0．0040．979±0．0071．298±0．009pGSadeno?shRELMα/FIZZ10．352±0．0030．405±0．006#0．796±0．005#0．907±0．004#

*P<0.05vspGSadeno-HK group；#P<0.05vspGSadeno-shRNA control group.

表3活細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)感染腺病毒的MAEC和MOVAS細(xì)胞增殖能力的變化

Table 3. The viable cell number counting was udes to detect the proliferation ability the MAEC and MOVAS cells infected with adenovirus (×103viable cell numbers. Mean±SD.n=3)

CellsGroup0d1d2d3d4dMAECpGSadeno?HK3．480±0．0304．173±0．0407．787±0．0914．109±5．3015．319±6．860pGSadeno?RELMα/FIZZ13．574±0．0645．377±0．055?9．063±0．047?12．857±0．160?17．433±0．106?pGSadeno?shRNAcontrol3．493±0．0214．277±0．0457．687±0．03510．840±0．38713．477±0．170pGSadeno?shRNARELMα/FIZZ13．413±0．0214．057±0．0576．560±0．050#8．177±0．051#9．897±0．110#MOVASpGSadeno?HK3．587±0．0214．737±0．0477．493±0．0359．417±0．10112．783±0．230pGSadeno?RELMα/FIZZ13．553±0．0295．020±0．046?8．630±0．069?11．870±0．131?15．383±0．078?pGSadeno?shRNAcontrol3．667±0．0514．477±0．0427．653±0．0519．787±0．07412．977±0．095pGSadeno?shRELMα/FIZZ13．517±0．0314．050±0．061#6．663±0．090#9．575±0．046#9．070±0．040#

*P<0.05vspGSadeno-HK group；#P<0.05vspGSadeno-shRNA control group.

Figure 2. The angiogenesis of the MAEC (×100). Mean±SD.n=3.*P<0.05vspGSadebo-HK group#P<0.05vspGSadeno-shRNA control group.

圖2MAEC的血管生成情況

Figure 3. The changes of Ca2+concentration in the MOVAS cells. Mean±SD.n=3.▲P<0.05vspGSadeno-HK group;△P<0.05vspGSadeno-shRNA control group.

圖3MOVAS細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的變化

Figure 4. The effects of RELMα/FIZZ1 on the protein expression of CaM and MLCK in the MOVAS cells. Mean±SD.n=3.▲P<0.05vspGSadeno-HK group;△P<0.05vspGSadeno-shRNA control group.

圖4RELMα/FIZZ1對(duì)MOVAS細(xì)胞內(nèi)CaM與MLCK蛋白表達(dá)的影響

Figure 5. The effects of RELMα/FIZZ1 on the mRNA expression of CaM and MLCK in the MOVAS cells. Mean±SD.n=3.▲P<0.05vspGSadeno-HK group;△P<0.05vspGSadeno-shRNA control group.

圖5RELMα/FIZZ1對(duì)MOVAS細(xì)胞內(nèi)CaM與MLCKmRNA表達(dá)的影響

討 論

易損斑塊(vulnerable plaque)是動(dòng)脈粥樣硬化斑塊(atheromatous plaque)的重要類(lèi)型，是動(dòng)脈血管壁上的病理性結(jié)構(gòu)。斑塊改變了血管壁的組織結(jié)構(gòu)，使得血管管腔狹窄，血流阻力增加；血流動(dòng)力學(xué)也發(fā)生改變，流體剪切力加強(qiáng)，血管內(nèi)皮(endothelium)損傷加重；同時(shí)，斑塊內(nèi)包含了大量脂質(zhì)和血細(xì)胞。當(dāng)斑塊收到較強(qiáng)流體剪切力的作用或血管收縮痙攣時(shí)，脆弱的被膜破裂，使得斑塊內(nèi)容物沖刷進(jìn)入血管，形成血栓，是導(dǎo)致突發(fā)心腦血管事件(如心肌梗塞和腦卒中等)的關(guān)鍵因素[4]。易損斑塊具有特別的病理性結(jié)構(gòu)，斑塊的管腔面是薄纖維帽(thin fibrous cap)，中間是由脂質(zhì)組成的壞死核心區(qū)(necro-tic core)，周邊浸潤(rùn)了大量的以巨噬細(xì)胞(macro-phage)和T細(xì)胞為主的血細(xì)胞，伴隨著逐漸增強(qiáng)的斑塊炎癥反應(yīng)(plaque inflammation)、正性血管重構(gòu)(positive vascularremodeling)、滋養(yǎng)血管新生(vasa-vasorum neovascularization)和斑塊內(nèi)出血(intra-plaque hemorrhage)[5]。

最近研究表明，新生血管是血脂沉積斑塊局部的重要通道之一，生長(zhǎng)入斑塊內(nèi)具有高通透性的新生血管為斑塊中脂蛋白的主要來(lái)源，致使大的纖維帽覆蓋下斑塊中的脂質(zhì)聚集仍在進(jìn)行，斑塊內(nèi)新生血管管壁發(fā)育不完善，容易破碎，它的臨床重要性在于與斑塊內(nèi)出血、斑塊破裂和不穩(wěn)定型心絞痛高度相關(guān)[6]，在易損斑塊滋養(yǎng)血管的新生方面，局部浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞扮演了重要的角色，一方面，巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)和激活，另一方面，巨噬細(xì)胞釋放炎癥因子啟動(dòng)相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增生[7]。

FIZZ1是2000年新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)與炎癥相關(guān)的缺氧誘導(dǎo)有絲分裂因子，是運(yùn)用表達(dá)序列標(biāo)記數(shù)據(jù)庫(kù)掃描的方法發(fā)現(xiàn)的一種分泌型蛋白。目前發(fā)現(xiàn)，缺氧、高血糖和吸煙等能刺激巨噬細(xì)胞中RELMα/FIZZ1表達(dá)，而脂多糖能下調(diào)脂肪組織中RELMα/FIZZ1表達(dá)[8-9]。研究表明，RELMα/FIZZ1能刺激肺血管平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移，明顯促進(jìn)肺組織血管新生。Sun等[10]在檢測(cè)哮喘患者肺組織內(nèi)的新生血管時(shí)發(fā)現(xiàn)，RELMα/FIZZ1在肺血管以及巨噬細(xì)胞內(nèi)明顯表達(dá)，其表達(dá)強(qiáng)度與血管新生面積明顯正相關(guān)；RELMα/FIZZ1在培養(yǎng)的肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞以及鼠哮喘模型體內(nèi)也有類(lèi)似的發(fā)現(xiàn)[11]。

目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于RELMα/FIZZ1蛋白在呼吸系統(tǒng)疾病中的研究較多，主要集中在缺氧性肺血管重構(gòu)、肺纖維化、過(guò)敏性肺病及肺發(fā)育和肺動(dòng)脈高壓等過(guò)程中的作用。而在心血管疾病方面僅為初步研究，RELMα/FIZZ1與動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展中血管新生、血管功能與斑塊易損性關(guān)系的報(bào)道甚少。本課題組首先在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)證實(shí)了RELMα/FIZZ1的表達(dá)[12]，利用RELMα/FIZZ1 刺激大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)處理組細(xì)胞的體外血管新生數(shù)目均明顯高于正常對(duì)照組，且呈劑量依賴性，明確了RELMα/FIZZ1在動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程中血管生成開(kāi)關(guān)基因的地位[12-13]。

本研究結(jié)果提示，過(guò)表達(dá)RELMα/FIZZ1可顯著提高M(jìn)AEC的增殖能力，管腔的形成數(shù)目顯著增加；干擾RELMα/FIZZ1的表達(dá)抑制MAEC的活力和管腔的形成，通過(guò)調(diào)節(jié)斑塊內(nèi)RELMα/FIZZ1表達(dá)，影響動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)血管新生，進(jìn)而影響動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊的進(jìn)展。過(guò)表達(dá)RELMα/FIZZ1顯著增高M(jìn)OVAS細(xì)胞的活力和細(xì)胞內(nèi)Ca2+平均熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)CaM和MLCK蛋白和mRNA表達(dá)顯著升高；干擾RELMα/FIZZ1的表達(dá)顯著抑制MOVAS細(xì)胞的活力，降低細(xì)胞內(nèi)Ca2+平均熒光強(qiáng)度，抑制CaM和MLCK 的mRNA和蛋白表達(dá)。RELMα/FIZZ1刺激血管平滑肌細(xì)胞后，可引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的升高，活化CaM，與鈣離子結(jié)合后，可能會(huì)引起某些通路激活，進(jìn)而對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊的穩(wěn)定性產(chǎn)生影響。

綜上所述RELMα/FIZZ1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可影響動(dòng)脈粥樣硬化中管腔生成的動(dòng)態(tài)平衡及管腔功能，從而影響斑塊易損性，對(duì)臨床動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊防治機(jī)制的探索和尋找新的治療靶點(diǎn)均具有十分重要的意義。

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