Salubrinal通過(guò)調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞發(fā)育改善骨關(guān)節(jié)炎脛骨平臺(tái)不均勻沉降

高哲，李心樂(lè)，2，李杰 ，2，張平 ，2△

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是最常見(jiàn)的全關(guān)節(jié)病，流行病學(xué)調(diào)查顯示世界范圍內(nèi)有超過(guò)7億人口患有OA［1］。其是導(dǎo)致殘疾的主要原因，給家庭和社會(huì)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［2-3］。OA的主要特征為軟骨下骨的異常骨重建、內(nèi)外側(cè)脛骨平臺(tái)不均勻沉降和軟骨的損傷。在OA疾病中，軟骨和軟骨下骨形成一個(gè)整體并相互影響，在OA發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用［4］。軟骨下骨的病變加重了關(guān)節(jié)軟骨的病理改變，加速了OA的病程進(jìn)展［5］。本課題組前期研究表明，在OA動(dòng)物模型中破骨細(xì)胞活性及功能明顯增高，破骨細(xì)胞活性升高與軟骨病變和軟骨下骨的骨吸收呈正相關(guān)［6］。有研究顯示，在OA動(dòng)物和患者的軟骨下骨中，抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均顯著增多［7］。另外，張英澤院士在2014年提出不均勻沉降理論，即由于關(guān)節(jié)病變引起的承重骨受力不均導(dǎo)致不均勻沉降現(xiàn)象。膝關(guān)節(jié)脛骨平臺(tái)的軟骨下骨為松質(zhì)骨區(qū)，也是負(fù)重面最大的部位，這樣的解剖生理特征導(dǎo)致膝關(guān)節(jié)炎多發(fā)生脛骨平臺(tái)內(nèi)外側(cè)不均勻沉降現(xiàn)象［8］。因此，本課題組推測(cè)，抑制異常破骨細(xì)胞活性、糾正異常骨重建和脛骨平臺(tái)內(nèi)外側(cè)不均勻沉降現(xiàn)象可能是治療OA的一種方法。

Salubrinal是一種化學(xué)合成劑，能抑制真核翻譯起始因子2α（eIF2α）的去磷酸化水平［9］。本課題組前期工作證實(shí)，Salubrinal可促進(jìn)骨創(chuàng)傷的愈合［10］，抑制破骨細(xì)胞的發(fā)育［11］，可用于治療骨質(zhì)疏松［12］和股骨頭壞死［13］。還有研究顯示，Salubrinal可通過(guò)下調(diào)核因子-κB（NF-κB）信號(hào)、抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-13（MMP-13）的表達(dá)和活性，對(duì)OA軟骨的損傷有保護(hù)作用［14-15］。但其對(duì)OA軟骨下骨的治療作用以及是否能改變不均勻沉降現(xiàn)象尚不清楚。本研究采用手術(shù)切除小鼠膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)半月板建立OA模型，造成膝關(guān)節(jié)穩(wěn)定性失衡，觀察脛骨平臺(tái)病理改變和Salubrinal對(duì)小鼠OA的治療效果，以期為OA的治療提供更多依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 30只SPF級(jí)雌性C57BL/6小鼠，約14周齡，體質(zhì)量18～20 g，由中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。每籠5只小鼠，自由攝取飼料和水。所有實(shí)驗(yàn)根據(jù)天津醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理規(guī)定進(jìn)行，并經(jīng)天津醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 主要試劑 Salubrinal購(gòu)自英國(guó)Tocris Bioscience公司。細(xì)胞因子購(gòu)自美國(guó)PeproTech公司。α-MEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。胎牛血清、青霉素、鏈霉素和胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。番紅O染料、萘酚AS-MX磷酸鹽（Naphthol AS-MX phosphate）、快速紅TR鹽（Fast red TR salt）、結(jié)晶紫、TRAP染色試劑盒等其他化學(xué)品購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.1.3 染液配制 1%番紅O：5 g番紅O染料+500 mL蒸餾水。TRAP染液：0.2 mol/L醋酸鹽緩沖液50 mL+萘酚AS-MX磷酸鹽25 mg+快速紅TR鹽55 mg。0.5%結(jié)晶紫染液：500 mg結(jié)晶紫+25 mL甲醇+75 mL蒸餾水。

1.1.4 主要儀器 石蠟切片機(jī)（RM2255）購(gòu)自德國(guó)Leica公司。倒置相差顯微鏡（CKX41SF）及普通雙目正置顯微鏡（BX41-12H02）購(gòu)自日本Olympus公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組 采用隨機(jī)數(shù)字表法將30只C57BL/6雌性小鼠分為假手術(shù)（Sham）組、OA組、OA+Salubrinal藥物治療（OA+Sal）組，每組10只。

1.2.2 動(dòng)物模型制備 用1.5%異氟烷麻醉小鼠，于膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)打開(kāi)關(guān)節(jié)腔，使用手術(shù)顯微鏡和顯微外科技術(shù)切除內(nèi)側(cè)半月板。對(duì)于Sham組，只切開(kāi)關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)皮膚。術(shù)后使用丁丙諾啡鹽酸鹽鎮(zhèn)痛抗感染。

1.2.3 給藥方法 手術(shù)造模后，給予OA+Sal組小鼠皮下注射Salubrinal（1 mg/kg），每日1次，連續(xù)2周。同時(shí)給予Sham組及OA組小鼠等量的生理鹽水。

1.2.4 組織學(xué)分析

1.2.4.1 組織處理 脫頸法處死小鼠后，剝離小鼠后腿，剔除皮膚、軟組織及韌帶，保留完整腿骨及膝關(guān)節(jié)囊。將膝關(guān)節(jié)標(biāo)本在10%中性甲醛溶液中固定2d，并在14%乙二胺四乙酸（EDTA）中脫鈣2周，梯度乙醇脫水、透明，石蠟包埋標(biāo)本，冠狀位組織切片，厚度為5 μm。

1.2.4.2 番紅O染色 組織切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化后，1%番紅O染液染色30 min，脫水、透明后樹膠封片，顯微鏡下觀察組織病理形態(tài)學(xué)改變，評(píng)估關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨板（SBP）的組織學(xué)改變。每張切片在脛骨平臺(tái)的軟骨區(qū)域分別從內(nèi)外側(cè)的承重區(qū)選取3個(gè)400倍視野。通過(guò)國(guó)際骨關(guān)節(jié)炎研究協(xié)會(huì)（OARSI）評(píng)分對(duì)軟骨損傷進(jìn)行評(píng)分，測(cè)量鈣化軟骨厚度（CC）和全層關(guān)節(jié)軟骨厚度（TAC），并計(jì)算鈣化軟骨與關(guān)節(jié)軟骨的比值（CC/TAC），評(píng)估軟骨病變。測(cè)量SBP厚度，評(píng)估軟骨下骨板的變化。

1.2.4.3 TRAP染色 組織切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化后，放入配置好的TRAP染液中染色60 min，脫水、透明后水溶性封片劑封片，顯微鏡下觀察軟骨下骨組織病理形態(tài)學(xué)改變，評(píng)估軟骨下骨的骨面積分?jǐn)?shù)和破骨細(xì)胞數(shù)量的變化。每張切片在脛骨平臺(tái)的軟骨下骨部分分別從內(nèi)外側(cè)的承重區(qū)選取3個(gè)200倍視野，計(jì)算單位面積內(nèi)的骨面積分?jǐn)?shù)（B.Ar/T.Ar）和TRAP染色陽(yáng)性細(xì)胞長(zhǎng)度占骨小梁長(zhǎng)度的百分比（Oc.S/BS）。

1.2.4.4 內(nèi)外側(cè)脛骨平臺(tái)倍數(shù)變化分析 為了比較內(nèi)外側(cè)脛骨平臺(tái)的病變程度和療效，采用OA組每個(gè)標(biāo)本OARSI評(píng)分和B.Ar/T.Ar的評(píng)估值除以Sham組對(duì)應(yīng)指標(biāo)的均值，計(jì)算OA小鼠相對(duì)于Sham小鼠內(nèi)外側(cè)脛骨平臺(tái)的變化倍數(shù)。同樣，用OA+Sal組每個(gè)標(biāo)本OARSI評(píng)分和B.Ar/T.Ar的評(píng)估值除以O(shè)A組對(duì)應(yīng)指標(biāo)的均值，計(jì)算Salubrinal對(duì)OA小鼠內(nèi)外側(cè)脛骨平臺(tái)的恢復(fù)倍數(shù)。進(jìn)而比較內(nèi)外側(cè)脛骨平臺(tái)倍數(shù)變化。

1.2.5 細(xì)胞學(xué)分析

1.2.5.1 收集骨髓來(lái)源細(xì)胞 小鼠安樂(lè)死后，用含有胎牛血清（FBS）的Iscove’s MEM沖洗雙側(cè)髂骨，收集骨髓來(lái)源的細(xì)胞，低密度梯度離心法分離出骨髓單個(gè)核細(xì)胞，并在顯微鏡下用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，用于以下細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

1.2.5.2 破骨細(xì)胞形成實(shí)驗(yàn) 將分離出的骨髓單個(gè)核細(xì)胞均勻混懸于α-MEM培養(yǎng)液，種入96孔板中，密度為1×105/孔，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d。培養(yǎng)液中含有10%FBS、30 μg/L小鼠巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF）和20 μg/L小鼠核因子kappa-B配體的受體激活因子（RANKL）。在第4 天，更換為含有 10%FBS，30 μg/L M-CSF 和 60 μg/L RANKL的α-MEM培養(yǎng)基，第6天按照TRAP染色試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行TRAP染色。顯微鏡下觀察、拍片，每孔隨機(jī)選取5個(gè)200倍視野，測(cè)量胞核＞3個(gè)的融合破骨細(xì)胞的面積，計(jì)算單位面積內(nèi)融合破骨細(xì)胞所覆蓋的區(qū)域Oc.Ar（%）。

1.2.5.3 破骨細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 使用transwell實(shí)驗(yàn)評(píng)估破骨細(xì)胞的遷移能力。誘導(dǎo)骨髓來(lái)源的單個(gè)核細(xì)胞形成前破骨細(xì)胞，培養(yǎng)液為含10%FBS和30 μg/L M-CSF的α-MEM培養(yǎng)基，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4d。遷移實(shí)驗(yàn)采用transwell小室（小孔直徑8 μm）進(jìn)行檢測(cè)。在transwell小室外加入含有1%胎牛血清白蛋白（BSA）和30 μg/L M-CSF的α-MEM培養(yǎng)基，誘導(dǎo)小室壁內(nèi)無(wú)營(yíng)養(yǎng)條件的前破骨細(xì)胞遷移至小室壁外。將前破骨細(xì)胞種入transwell小室內(nèi)，密度為1×105/孔，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h。常溫下0.5%結(jié)晶紫染液染色30 min，顯微鏡下觀察、拍片，每孔隨機(jī)選取5個(gè)200倍視野，計(jì)數(shù)視野內(nèi)遷移的前破骨細(xì)胞的數(shù)量（migrated cells/FV），代表破骨細(xì)胞的遷移能力。

1.2.5.4 破骨細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn) 為了測(cè)定破骨細(xì)胞的黏附性，將骨髓來(lái)源的單個(gè)核細(xì)胞誘導(dǎo)形成前破骨細(xì)胞，方法同上。將前破骨細(xì)胞種入1%明膠包被好的96孔板中，密度為1×105/孔，培養(yǎng)液為含10%FBS和30 μg/L M-CSF的α-MEM培養(yǎng)基，放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1h。用無(wú)水甲醇在室溫下固定15 min，0.5%結(jié)晶紫染液染色，顯微鏡下觀察、拍片，每孔隨機(jī)選取5個(gè)200倍視野，計(jì)數(shù)視野內(nèi)黏附的前破骨細(xì)胞的數(shù)量（Adherent cells/FV），代表破骨細(xì)胞的黏附能力。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間多重比較行LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Salubrinal對(duì)OA小鼠內(nèi)側(cè)脛骨平臺(tái)軟骨損傷的改善作用 番紅O組織學(xué)染色結(jié)果顯示，與Sham組相比，OA組小鼠內(nèi)側(cè)脛骨平臺(tái)軟骨表面不連續(xù)，軟骨層著色變淺，大量基質(zhì)丟失，軟骨細(xì)胞數(shù)目減少，并有大量軟骨細(xì)胞出現(xiàn)肥大和凋亡，軟骨病變范圍＞50%，OARSI評(píng)分顯著升高（P＜0.05）；透明軟骨（HC）明顯變薄，鈣化軟骨增厚，CC/TAC顯著增高（P＜0.05）。經(jīng)Salubrinal治療后，OA+Sal組小鼠內(nèi)側(cè)脛骨平臺(tái)軟骨表面連續(xù)，抑制了基質(zhì)丟失，軟骨層著色得到改善，軟骨細(xì)胞肥大和凋亡明顯減少，軟骨病變范圍＜25%，OARSI評(píng)分顯著降低（P＜0.05）、CC/TAC得到恢復(fù)（P＜0.05）。見(jiàn)表1、圖1。

Tab.1 Comparison of injury condition of medial tibial plateau cartilage between three groups表1 各組小鼠內(nèi)側(cè)脛骨平臺(tái)軟骨損傷情況比較（n=10，±s）

Tab.1 Comparison of injury condition of medial tibial plateau cartilage between three groups表1 各組小鼠內(nèi)側(cè)脛骨平臺(tái)軟骨損傷情況比較（n=10，±s）

＊P＜0.05；a與Sham組比較，b與OA組比較，P＜0.05

組別Sham組OA組OA+Sal組F OARSI評(píng)分（分）0.80±0.13 11.35±1.46a 4.70±0.30ab 37.900＊CC/TAC（%）49.11±1.14 61.62±1.16a 48.19±1.17b 42.310＊

2.2 Salubrinal對(duì)OA小鼠外側(cè)脛骨平臺(tái)軟骨的保護(hù)作用 番紅O組織學(xué)染色結(jié)果顯示，與Sham組相比，OA組小鼠外側(cè)脛骨平臺(tái)軟骨有輕微纖維化表現(xiàn)，染色變淺，軟骨病變范圍為10%～25%，OARSI評(píng)分顯著升高（P＜0.05）；鈣化軟骨增厚，CC/TAC明顯增高（P＜0.05）。經(jīng)Salubrinal治療后，OA+Sal組小鼠外側(cè)脛骨平臺(tái)軟骨細(xì)胞恢復(fù)正常，表面完整、無(wú)纖維化表現(xiàn)，OARSI評(píng)分顯著降低（P＜0.05），CC/TAC也得到糾正（P＜0.05）。見(jiàn)圖2、表2。

Fig.1 Morphological examination of the medial tibial plateau cartilage with Safranine O staining（× 400）圖1 脛骨平臺(tái)內(nèi)側(cè)軟骨組織形態(tài)學(xué)結(jié)果（番紅O染色，×400）

Fig.2 Morphological examination of the lateral tibial plateau cartilage with Safranine O staining（× 400）圖2 脛骨平臺(tái)外側(cè)軟骨組織形態(tài)學(xué)結(jié)果（番紅O染色，×400）

Tab.2 Comparison of injury condition of lateral tibial plateau cartilage between three groups表2 各組小鼠外側(cè)脛骨平臺(tái)軟骨損傷情況比較（n=10，±s）

Tab.2 Comparison of injury condition of lateral tibial plateau cartilage between three groups表2 各組小鼠外側(cè)脛骨平臺(tái)軟骨損傷情況比較（n=10，±s）

＊P＜0.05；a與Sham組比較，b與OA組比較，P＜0.05

組別Sham組OA組OA+Sal組F OARSI評(píng)分（分）0.60±0.16 3.50±0.58a 1.20±0.11ab 18.610＊CC/TAC（%）41.44±2.29 49.75±2.12a 41.68±1.86b 5.086＊

2.3 Salubrinal對(duì)OA小鼠內(nèi)側(cè)脛骨平臺(tái)軟骨下骨異常骨重建的糾正作用 TRAP組織學(xué)染色結(jié)果顯示，與Sham組相比，OA組小鼠內(nèi)側(cè)脛骨平臺(tái)向遠(yuǎn)側(cè)端塌陷，軟骨下骨B.Ar/T.Ar明顯增加，TRAP陽(yáng)性細(xì)胞比例（Oc.S/BS）顯著增高（P＜0.05）。經(jīng)Salubrinal治療后，OA+Sal組小鼠內(nèi)側(cè)脛骨平臺(tái)無(wú)塌陷，軟骨下骨B.Ar/T.Ar明顯恢復(fù)（P＜0.05），TRAP陽(yáng)性細(xì)胞減少，Oc.S/BS顯著降低（P＜0.05）。SBP厚度各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表3、圖3。

Tab.3 Comparison of the pathological changes in medial tibial plateau subchondral bone between three groups表3 各組小鼠內(nèi)側(cè)脛骨平臺(tái)軟骨下骨病理改變情況比較（n=10，±s）

Tab.3 Comparison of the pathological changes in medial tibial plateau subchondral bone between three groups表3 各組小鼠內(nèi)側(cè)脛骨平臺(tái)軟骨下骨病理改變情況比較（n=10，±s）

＊P＜0.05；a與Sham組比較，b與OA組比較，P＜0.05

組別Sham組OA組OA+Sal組F B.Ar/T.Ar（%）58.08±1.24 66.95±1.59a 60.16±1.89b 8.023＊SBP厚度（μm）50.80±3.64 57.26±5.14 45.09±2.56 2.277 Oc.S/BS（%）5.12±0.55 9.66±1.10a 3.63±0.89b 11.310＊

2.4 Salubrinal對(duì)OA小鼠外側(cè)脛骨平臺(tái)軟骨下骨異常骨吸收的抑制作用 TRAP組織學(xué)染色結(jié)果顯示，與Sham組相比，OA組小鼠外側(cè)脛骨平臺(tái)軟骨下骨未出現(xiàn)塌陷，但骨小梁變細(xì)且出現(xiàn)橫向走行，B.Ar/T.Ar和SBP厚度明顯降低（P＜0.05），Oc.S/BS顯著增加（P＜0.05）。經(jīng)Salubrinal治療后，OA+Sal組小鼠外側(cè)脛骨平臺(tái)軟骨下骨小梁恢復(fù)正常，B.Ar/T.Ar和SBP明顯恢復(fù)（P＜0.05），TRAP陽(yáng)性細(xì)胞減少，Oc.S/BS顯著降低（P＜0.05）。見(jiàn)表4、圖4。

Fig.3 Morphological observation of the medial tibial plateau subchondral bone with TRAP staining（× 200）圖3 脛骨平臺(tái)內(nèi)側(cè)軟骨下骨組織形態(tài)學(xué)結(jié)果（TRAP染色，×200）

Tab.4 Comparion of the pathological changes in lateral tibial plateau subchondral bone between three groups表4 各組小鼠外側(cè)脛骨平臺(tái)軟骨下骨病理改變情況比較（n=10，±s）

Tab.4 Comparion of the pathological changes in lateral tibial plateau subchondral bone between three groups表4 各組小鼠外側(cè)脛骨平臺(tái)軟骨下骨病理改變情況比較（n=10，±s）

＊P＜0.05；a與Sham組比較，b與OA組比較，P＜0.05

組別Sham組OA組OA+Sal組F B.Ar/T.Ar（%）49.02±1.64 43.55±2.33a 50.01±1.91b 5.930＊SBP厚度（μm）54.85±3.40 21.47±1.25a 44.69±3.12ab 38.360＊Oc.S/BS（%）4.73±0.77 10.95±1.02a 6.44±1.31b 7.834＊

2.5 OA小鼠內(nèi)側(cè)脛骨平臺(tái)的病理改變較外側(cè)嚴(yán)重 在OA小鼠的內(nèi)外側(cè)脛骨平臺(tái)中均發(fā)生了軟骨下骨重建和軟骨損傷。與Sham組相比，OA小鼠OARSI評(píng)分和B.Ar/T.Ar在內(nèi)側(cè)脛骨平臺(tái)的倍數(shù)變化明顯高于外側(cè)脛骨平臺(tái)（P＜0.05）。與OA組相比，OA+Sal組小鼠內(nèi)外側(cè)脛骨平臺(tái)OARSI評(píng)分的倍數(shù)變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而B.Ar/T.Ar在內(nèi)側(cè)脛骨平臺(tái)的倍數(shù)變化明顯低于外側(cè)脛骨平臺(tái)（P＜0.05）。見(jiàn)表5。

Tab.5 Comparison of the cartilage and subchondral bone fold changes between medial and lateral tibial plateau表5 內(nèi)外側(cè)脛骨平臺(tái)軟骨、軟骨下骨的倍數(shù)變化比較（n=10，±s）

Tab.5 Comparison of the cartilage and subchondral bone fold changes between medial and lateral tibial plateau表5 內(nèi)外側(cè)脛骨平臺(tái)軟骨、軟骨下骨的倍數(shù)變化比較（n=10，±s）

＊P＜0.05

組別內(nèi)側(cè)脛骨平臺(tái)外側(cè)脛骨平臺(tái)t OA組/Sham組倍數(shù)變化OARSI評(píng)分14.19±1.83 5.83±0.97 4.033＊B.Ar/T.Ar 1.15±0.03 0.89±0.02 7.938＊OA+Sal組/OA組倍數(shù)變化OARSI評(píng)分0.41±0.03 0.34±0.03 1.631 B.Ar/T.Ar 0.89±0.03 1.14±0.04 5.142＊

2.6 Salubrinal對(duì)OA破骨細(xì)胞過(guò)度分化的抑制作用 骨髓來(lái)源細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與Sham組比較，OA組破骨細(xì)胞發(fā)育迅速，大的融合細(xì)胞顯著增多，定量分析融合破骨細(xì)胞所覆蓋的區(qū)域顯示Oc.Ar明顯增大（P＜0.05）；破骨細(xì)胞的遷移和黏附細(xì)胞數(shù)量也顯著增加（P＜0.05）。經(jīng)Salubrinal治療后，OA+Sal組有效抑制了破骨細(xì)胞的發(fā)育，減緩了破骨細(xì)胞的融合，Oc.Ar明顯減?。≒＜0.05），破骨細(xì)胞的遷移和黏附細(xì)胞數(shù)量也顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)表6、圖5。

Tab.6 Comparion of formation,migration and adhesion of osteoclasts between three groups表6 各組小鼠破骨細(xì)胞形成、遷移、黏附能力的比較（n=10，±s）

Tab.6 Comparion of formation,migration and adhesion of osteoclasts between three groups表6 各組小鼠破骨細(xì)胞形成、遷移、黏附能力的比較（n=10，±s）

＊P＜0.05；a與Sham組比較，b與OA組比較，P＜0.05

組別Sham組OA組OA+Sal組F Oc.Ar（%）28.58±1.38 62.43±2.52a 45.60±1.24ab 94.84＊遷移細(xì)胞數(shù)（個(gè)）266.10±7.30 335.40±9.48a 245.60±7.61b 32.51＊黏附細(xì)胞數(shù)（個(gè)）114.10±10.11 435.90±24.08a 63.60±4.62ab 76.15＊

3 討論

3.1 破骨細(xì)胞活性升高導(dǎo)致的骨重建在OA發(fā)生發(fā)展中有重要作用 很多研究認(rèn)為，軟骨下骨和間充質(zhì)干細(xì)胞中破骨細(xì)胞活性增加導(dǎo)致的骨重建在骨關(guān)節(jié)炎軟骨退變的起始和進(jìn)展中有關(guān)鍵作用［16-18］。本研究結(jié)果顯示，在手術(shù)切除膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)半月板誘發(fā)的OA小鼠模型中，軟骨下骨中破骨細(xì)胞活性明顯增高，骨髓來(lái)源的破骨細(xì)胞的發(fā)育顯著加快，內(nèi)側(cè)脛骨平臺(tái)軟骨下骨B.Ar/T.Ar增高，與此相對(duì)應(yīng)的外側(cè)脛骨平臺(tái)出現(xiàn)了SBP變薄，B.Ar/T.Ar降低，內(nèi)外側(cè)脛骨平臺(tái)軟骨下骨出現(xiàn)異常骨重建，OARSI評(píng)分、CC/TAC增高，關(guān)節(jié)軟骨受到了明顯的損傷。Salubrinal明顯降低了軟骨下骨中Oc.S/BS和骨髓來(lái)源的破骨細(xì)胞的形成、遷移、黏附能力，降低了內(nèi)側(cè)脛骨平臺(tái)B.Ar/T.Ar，增加了外側(cè)脛骨平臺(tái)SBP厚度和B.Ar/T.Ar，明顯抑制了脛骨平臺(tái)軟骨下骨的骨重建，OARSI評(píng)分和CC/TAC也明顯恢復(fù)。結(jié)果表明，OA中破骨細(xì)胞異?；钴S，導(dǎo)致了異常骨重建的發(fā)生，并加速了關(guān)節(jié)軟骨的病變。Salubrinal可明顯抑制破骨細(xì)胞的異?；钴S，通過(guò)抑制破骨細(xì)胞發(fā)育來(lái)調(diào)節(jié)軟骨下骨異常骨重建，保持軟骨下骨的骨形態(tài)，從而延緩了OA關(guān)節(jié)軟骨的病變。

Fig.4 Morphological observation of the lateral tibial plateau subchondral bone with TRAP staining（× 200）圖4 脛骨平臺(tái)外側(cè)軟骨下骨組織形態(tài)學(xué)結(jié)果（TRAP染色，×200）

Fig.5 Pictures showing formation,migration and adhesion of osteoclasts（× 200）圖5 破骨細(xì)胞的形成、遷移、黏附功能（×200）

3.2 OA脛骨平臺(tái)內(nèi)外側(cè)軟骨下骨出現(xiàn)了不均勻沉降 張英澤院士提出膝關(guān)節(jié)的脛骨平臺(tái)是負(fù)重面最大的關(guān)節(jié)，由于內(nèi)側(cè)無(wú)骨性阻擋，且外側(cè)有腓骨支撐，負(fù)重點(diǎn)向內(nèi)側(cè)偏移，因此內(nèi)外側(cè)平臺(tái)發(fā)生不均勻沉降［8］。本研究選取冠狀位切片，分別觀測(cè)OA模型小鼠內(nèi)外側(cè)脛骨平臺(tái)的病理改變及治療效果。相比矢狀位切片觀測(cè)結(jié)果更加完善，可以在同一截面對(duì)脛骨平臺(tái)內(nèi)外側(cè)進(jìn)行比較分析，更好地觀察分析脛骨平臺(tái)內(nèi)外側(cè)不均勻沉降現(xiàn)象，避免了只能觀測(cè)一側(cè)的局限性。研究中發(fā)現(xiàn)，OA小鼠的內(nèi)外側(cè)脛骨平臺(tái)軟骨下骨發(fā)生了不同變化。與Sham組相比，OA小鼠的內(nèi)側(cè)脛骨平臺(tái)B.Ar/T.Ar明顯增加，而外側(cè)B.Ar/T.Ar和SBP均明顯降低。內(nèi)外側(cè)脛骨平臺(tái)軟骨、軟骨下骨的倍數(shù)變化分析顯示，OA組內(nèi)側(cè)OARSI評(píng)分和B.Ar/T.Ar的倍數(shù)變化明顯大于外側(cè)。筆者分析是由于關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)半月板切除，穩(wěn)定性失衡，負(fù)重點(diǎn)向內(nèi)側(cè)偏移，內(nèi)側(cè)負(fù)荷異常增加而外側(cè)脛骨平臺(tái)出現(xiàn)了失重，導(dǎo)致的不均勻沉降現(xiàn)象。

3.3 Salubrinal改善OA不均勻沉降 張?jiān)菏客ㄟ^(guò)腓骨近端截骨手術(shù)降低脛骨平臺(tái)外側(cè)高度，減輕膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)關(guān)節(jié)面的生物應(yīng)力，防止脛骨平臺(tái)繼續(xù)發(fā)生不均勻沉降［8］。本研究采用Salubrinal對(duì)OA小鼠進(jìn)行治療。Salubrinal降低了內(nèi)側(cè)脛骨平臺(tái)B.Ar/T.Ar，抑制了平臺(tái)向遠(yuǎn)側(cè)端的塌陷，增加了外側(cè)脛骨平臺(tái)SBP厚度和B.Ar/T.Ar，顯著糾正了OA小鼠內(nèi)外側(cè)脛骨平臺(tái)的不均勻病變，明顯抑制了軟骨下骨的異常骨重建，改善了OA小鼠膝關(guān)節(jié)的不均勻沉降。使用Salubrinal治療OA避免了手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)，為其他原因?qū)е碌牟荒苁中g(shù)治療的患者提供了治療的可能。本實(shí)驗(yàn)采用OA小鼠模型進(jìn)行了研究，接下來(lái)還需進(jìn)一步的臨床實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

綜上所述，在OA動(dòng)物模型中Salubrinal抑制了OA中破骨細(xì)胞的異常發(fā)育，調(diào)節(jié)了內(nèi)外側(cè)脛骨平臺(tái)軟骨下骨的不均衡改變，抑制了異常骨重建和不均勻沉降。本研究為治療OA提供了新思路，通過(guò)調(diào)控破骨細(xì)胞發(fā)育、改善異常骨重建和不均勻沉降有望成為治療OA的新方法。

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