提高春季西瓜未授粉子房胚狀體誘導(dǎo)率的方法

閔子揚(yáng)鄒 甜阮萬輝孫小武*

（1湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖南長沙 410128；2湖南省蔬菜研究所，湖南長沙 410125）

西瓜（Citrullus lanatus）是葫蘆科重要的蔬菜作物之一，具有豐富的營養(yǎng)和保健功能，深受消費(fèi)者喜愛。我國作為西瓜的生產(chǎn)和消費(fèi)大國，其產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量的60%以上，但我國西瓜育種水平相對滯后，品種類型無法完全滿足市場需求，因此，提高我國西瓜育種水平、增強(qiáng)西瓜產(chǎn)業(yè)國際競爭力具有重要意義。

單倍體育種對于加速育種進(jìn)程、創(chuàng)新種質(zhì)資源、構(gòu)建遺傳圖譜等均具有重要意義（袁素霞 等，2010；Qiao et al.，2015）。單倍體的獲得方法主要有離體雄核培養(yǎng)和離體雌核培養(yǎng)，但在葫蘆科作物上以未授粉子房或胚珠為外植體的離體雌核培養(yǎng)為主（孫守如 等，2013；趙曉菲，2014）。離體雌核培養(yǎng)過程中再生植株的產(chǎn)生方式有兩種，一種是誘導(dǎo)形成愈傷組織后再分化產(chǎn)生芽，最后形成完整再生植株；另一種是以胚狀體發(fā)育途徑直接形成再生植株。相關(guān)研究表明，愈傷組織途徑形成的再生植株大部分起源于體細(xì)胞，而以胚狀體發(fā)育途徑形成的再生植株中單倍體植株的比例顯著高于以愈傷組織途徑形成的再生植株（Ramsay et al.，2003；趙珺，2007）。這提醒我們在進(jìn)行西瓜未授粉子房離體培養(yǎng)以創(chuàng)制單倍體植株的過程中，提高胚狀體的誘導(dǎo)率是一個需要解決的關(guān)鍵問題。

TDZ（噻苯隆）是一種新型植物生長調(diào)節(jié)劑，具有細(xì)胞分裂素和生長素的雙重功效，廣泛應(yīng)用于誘導(dǎo)植物愈傷組織形成和體細(xì)胞胚分化（徐曉峰和黃學(xué)林，2003），已在香蕉（魏岳榮 等，2007）、非洲紫羅蘭（楊先泉 等，2010）、南瓜（閔子揚(yáng) 等，2016）等作物的體細(xì)胞胚誘導(dǎo)中取得了較好效果。本試驗以TDZ為預(yù)處理激素，探討其對西瓜胚狀體誘導(dǎo)效果的影響。

參照前期研究（閔子揚(yáng) 等，2016），筆者已建立了一套誘導(dǎo)率較高的西瓜未授粉子房離體培養(yǎng)誘導(dǎo)胚狀體再生的技術(shù)體系，主要技術(shù)路線如下：以開花前一天的西瓜未授粉子房為材料，流水沖洗30 min后在超凈工作臺上用75%酒精消毒30 s，無菌水沖洗3次，去除子房外表皮后橫切成1 mm左右的薄片，然后在3%次氯酸鈉溶液中消毒2 min，無菌水沖洗5次后接種于MS+30 g·L-1蔗糖+7 g·L-1瓊脂粉+0.04 mg·L-1TDZ的誘導(dǎo)胚狀體發(fā)生的培養(yǎng)基上，35 ℃黑暗條件下熱激5 d后轉(zhuǎn)到組培室培養(yǎng)，28 d后統(tǒng)計胚狀體誘導(dǎo)率。通過上述技術(shù)體系能夠獲得較高的胚狀體誘導(dǎo)率，但試驗過程中發(fā)現(xiàn)材料的種植季節(jié)不同其誘導(dǎo)率存在顯著差異，春季西瓜未授粉子房胚狀體誘導(dǎo)率僅為3.5%，而秋季誘導(dǎo)率最高可達(dá)20.2%，并且這種現(xiàn)象在南瓜、西葫蘆等瓜類作物上也有報道（謝冰 等，2006；孫守如 等，2013）。為提高春季西瓜未授粉子房的胚狀體誘導(dǎo)率、延長試驗可操作時間、加速西瓜單倍體育種進(jìn)程，本試驗在前期已建立的西瓜未授粉子房離體培養(yǎng)誘導(dǎo)胚狀體再生技術(shù)體系的基礎(chǔ)上，以春季西瓜未授粉子房為研究對象，探索提高春季西瓜未授粉子房胚狀體誘導(dǎo)率的方法，以期能夠加速西瓜單倍體育種進(jìn)程，為我國西瓜種質(zhì)資源創(chuàng)新、新品種選育、基因工程相關(guān)研究提供幫助。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試西瓜品種為早佳8424，由湖南省蔬菜研究所提供。試驗材料于2016年4月10日定植在湖南省蔬菜研究所高橋科研基地的塑料大棚中，5月20日第2朵雌花出現(xiàn)時開始取樣接種。以下各處理每處理接種3瓶，每瓶9個外植體，3次重復(fù)。

1.2 試驗方法

1.2.1 果柄長度對胚狀體誘導(dǎo)率的影響 取樣時，分別以最長果柄、1/2果柄、無果柄3種類型（圖1）的西瓜未授粉子房為材料，用0.02 mg·L-1的TDZ溶液浸泡10 min后置于保濕盒中，15 ℃恒溫條件下放置2 d，然后按照已建立的技術(shù)體系進(jìn)行接種，培養(yǎng)28 d后分別統(tǒng)計西瓜未授粉子房胚狀體誘導(dǎo)率。

圖1 不同果柄長度的西瓜未授粉子房

1.2.2 激素預(yù)處理方式對胚狀體誘導(dǎo)率的影響 以果柄最長時的西瓜未授粉子房為材料，分別用0.01、0.02、0.03 mg·L-1的TDZ溶液浸泡5、10、15 min后置于保濕盒中，15 ℃恒溫條件下放置2 d，以不進(jìn)行激素預(yù)處理的材料為對照，然后按照已建立的技術(shù)體系進(jìn)行接種，培養(yǎng)28 d后分別統(tǒng)計西瓜未授粉子房胚狀體誘導(dǎo)率。

1.2.3 溫度預(yù)處理方式對胚狀體誘導(dǎo)率的影響 以果柄最長時的西瓜未授粉子房為材料，用0.02 mg·L-1的TDZ溶液浸泡10 min后置于保濕盒中，分別在10、15、20 ℃的恒溫條件下處理1、2、3 d，以不進(jìn)行溫度預(yù)處理的材料為對照，然后按照已建立的技術(shù)體系進(jìn)行接種，培養(yǎng)28 d后分別統(tǒng)計西瓜未授粉子房胚狀體誘導(dǎo)率。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS軟件對以上各數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和Duncan’s多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同果柄長度對西瓜胚狀體誘導(dǎo)率的影響

西瓜未授粉子房取樣后有一個預(yù)處理的過程，不會立刻接種，存放過程中需要消耗部分養(yǎng)分，果柄能夠為子房提供部分營養(yǎng)，因此不同果柄長度會對存放后子房的生理狀態(tài)產(chǎn)生影響。試驗結(jié)果表明，果柄最長時其胚狀體誘導(dǎo)率最高，達(dá)13.8%，而無果柄子房的胚狀體誘導(dǎo)率僅為2.6%，帶1/2果柄的胚狀體誘導(dǎo)率為4.4%，說明果柄長度越長，西瓜胚狀體誘導(dǎo)率越高。

2.2 激素預(yù)處理方式對西瓜胚狀體誘導(dǎo)率的影響

由表1可以看出，當(dāng)TDZ濃度為0時，不同預(yù)處理時間的胚狀體誘導(dǎo)率均處于較低水平，胚狀體生長狀況一般，總體不利于再生植株的獲得。TDZ濃度為0.01 mg·L-1時，相較于不用激素處理，其胚狀體誘導(dǎo)率顯著提高，當(dāng)預(yù)處理時間達(dá)到15 min時，誘導(dǎo)率可達(dá)6.0%。隨著TDZ濃度的進(jìn)一步提高，胚狀體誘導(dǎo)率仍有上升的空間。在TDZ濃度為0.02 mg·L-1或0.03 mg·L-1條件下，預(yù)處理時間為10 min或15 min時，各處理之間胚狀體誘導(dǎo)率差異不顯著且均處于較高水平，最高可達(dá)16.7%?？梢钥闯觯c未使用激素預(yù)處理相比，激素預(yù)處理能夠顯著提高胚狀體誘導(dǎo)率。但試驗過程中也發(fā)現(xiàn)，TDZ濃度達(dá)0.03 mg·L-1且激素預(yù)處理時間為10、15 min時，雖然胚狀體誘導(dǎo)率較高，但再生的胚狀體存在嚴(yán)重畸形，不利于再生植株的獲得。

2.3 溫度預(yù)處理方式對西瓜胚狀體誘導(dǎo)率的影響

如表2所示，在相同預(yù)處理溫度下，不同預(yù)處理時間之間胚狀體誘導(dǎo)率差異顯著并呈現(xiàn)出一定的趨勢，10 ℃或15 ℃時隨著預(yù)處理時間的延長，胚狀體誘導(dǎo)率呈先上升后下降的趨勢；20 ℃及室內(nèi)自然條件下隨著預(yù)處理時間的延長，胚狀體誘導(dǎo)率逐漸下降。預(yù)處理時間相同時，隨著預(yù)處理溫度的上升，胚狀體誘導(dǎo)率呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，在15 ℃預(yù)處理2 d時達(dá)到峰值，誘導(dǎo)率高達(dá)15.9%，15 ℃預(yù)處理時間達(dá)3 d時誘導(dǎo)率急劇下降，這可能是由于預(yù)處理時間過長子房生理狀態(tài)明顯下降造成的。試驗過程中還發(fā)現(xiàn)，如果西瓜子房在室內(nèi)自然條件下放置一段時間，其胚狀體誘導(dǎo)率顯著下降，放置時間達(dá)到3 d時其誘導(dǎo)率僅為2.8%，并且胚狀體存在嚴(yán)重的畸形現(xiàn)象，說明西瓜未授粉子房的生理狀態(tài)對胚狀體誘導(dǎo)率影響顯著。綜上認(rèn)為，在15 ℃條件下預(yù)處理2 d，能夠顯著提高春季西瓜未授粉子房的胚狀體誘導(dǎo)率，有利于再生植株的獲得。

表1 不同激素預(yù)處理方式對西瓜胚狀體誘導(dǎo)率的影響

表2 不同溫度預(yù)處理方式對西瓜胚狀體誘導(dǎo)率的影響

3 結(jié)論

提高春季西瓜未授粉子房胚狀體誘導(dǎo)率的方法為：摘取子房時盡量保留最長果柄，然后將帶最長果柄的西瓜未授粉子房用0.02 mg·L-1的TDZ溶液浸泡10 min，最后將其置于15 ℃恒溫條件下預(yù)處理2 d，預(yù)處理完成后進(jìn)行接種培養(yǎng)，能夠顯著改善春季西瓜未授粉子房胚狀體誘導(dǎo)率低的問題。通過上述預(yù)處理手段，能夠?qū)⒋杭疚鞴衔词诜圩臃康呐郀铙w誘導(dǎo)率從3.5%（圖2-A）提高到15.9%（圖2-B），雖然距秋季西瓜未授粉子房的胚狀體誘導(dǎo)率20.2%仍有差距，但仍顯著提高了試驗效率。

圖2 春季西瓜未授粉子房的胚狀體誘導(dǎo)

4 討論

相關(guān)研究證明TDZ具有細(xì)胞分裂素和生長素的雙重功效，在誘導(dǎo)愈傷組織形成和體細(xì)胞胚分化等一系列過程中均能發(fā)揮作用（徐曉峰和黃學(xué)林，2003）。本試驗使用0.02 mg·L-1的TDZ對春季西瓜未授粉子房進(jìn)行預(yù)處理，取得了較好的效果，能夠顯著提高其胚狀體誘導(dǎo)率且形成的胚狀體畸形率較低，說明TDZ有利于提高春季西瓜未授粉子房的胚狀體誘導(dǎo)率。2，4-D是誘導(dǎo)胚狀體發(fā)生的重要因素，許多植物離體胚狀體誘導(dǎo)均使用不同濃度的2，4-D，但胚狀體形成前后，外植體在含2，4-D的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)時間的長短卻因不同作物而異。筆者在前期試驗中發(fā)現(xiàn)，2，4-D能夠誘導(dǎo)西瓜胚狀體的發(fā)生且誘導(dǎo)效果明確，但誘導(dǎo)一段時間后需及時將外植體轉(zhuǎn)移到不含2，4-D的培養(yǎng)基上，步驟相對復(fù)雜。TDZ能夠取得與2，4-D相同的誘導(dǎo)效果且步驟簡單，因此，本試驗只對TDZ的預(yù)處理效果進(jìn)行了研究，其他激素的誘導(dǎo)效果有待進(jìn)一步研究。

倍性育種過程中經(jīng)常使用溫度預(yù)處理來改變配子體的生理狀態(tài)，提高再生植株的誘導(dǎo)率，這在西葫蘆（謝冰 等，2006）、黃瓜（杜勝利 等，2003）、甜瓜（韓麗華 等，2005）等作物上已經(jīng)得到廣泛證明。小孢子培養(yǎng)過程中一般在4 ℃進(jìn)行預(yù)處理，能夠取得較好的效果。大孢子培養(yǎng)時接種后一般在35 ℃進(jìn)行熱激處理，但處理效果卻有不同報道。本試驗采用15 ℃進(jìn)行接種前預(yù)處理，取得了較好的效果，這可能是由于春季西瓜未授粉子房發(fā)育時所處環(huán)境溫度變化較大，最低氣溫低，從而影響了子房的生理狀態(tài)，15 ℃恒溫處理2 d，有效改善了子房的生理狀態(tài)及激素水平，有利于后期誘導(dǎo)胚狀體形成。

本試驗有效改善了春季西瓜未授粉子房胚狀體誘導(dǎo)率過低的問題，顯著延長了試驗可操作時間，加速了西瓜單倍體育種進(jìn)程，試驗結(jié)果可為我國西瓜種質(zhì)資源創(chuàng)新、新品種選育、基因工程相關(guān)研究提供幫助。

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