活血生肌湯聯(lián)合外周血干細(xì)胞移植干預(yù)大鼠糖尿病足潰瘍模型的研究*

何雄文，牛美蘭

(1.河南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450004； 2.黃河科技學(xué)院，河南 鄭州 450063)

糖尿病足潰瘍是指未出現(xiàn)周圍神經(jīng)病變和周圍血管病變的初期糖尿病患者足部感染如甲溝炎、腳氣感染等所造成的足部感染、化膿、潰爛等。目前，干細(xì)胞移植治療下肢缺血已得到認(rèn)可。移植后的干細(xì)胞在體內(nèi)分化為平滑肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)血管生成因子分泌。將干細(xì)胞移植到缺血下肢，其分化形成新生毛細(xì)血管，可增加下肢血流量，達(dá)到治療下肢缺血的目的[1-2]。 活血生肌湯是針對糖尿病氣陰兩虛、瘀血阻絡(luò)病證研制的復(fù)方制劑，具有活血通絡(luò)、解痙止痛的功效。方劑中的紅花、丹參、乳香、赤芍、川芎、黨參、生黃芪等可活血祛瘀、調(diào)氣止痛、消腫生肌，對糖尿病微血管病有治療作用。本研究觀察了活血生肌湯聯(lián)合外周血干細(xì)胞移植對大鼠糖尿病足潰瘍模型新生血管形成及創(chuàng)面愈合的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng) 物

取健康清潔級雄性SD大鼠80只，體質(zhì)量110～140 g大鼠，購自山東省魯抗醫(yī)藥集團(tuán)有限公司，許可證編號(SCXK魯2015004)，存放在黃河科技學(xué)院動(dòng)物房，光照12 h/d，溫度20～23 ℃，相對濕度40%～60%。

1.2 藥品、試劑與儀器

活血生肌湯處方組成：紅花6 g，丹參 12 g，生黃芪 6 g，乳香 23 g，黨參 14 g，川芎6 g，赤芍14 g，大黃7 g，黃柏2 g，生地黃7 g。藥液由河南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院中藥制劑室提供，含生藥量1.25 g/mL。羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)，天津市永大化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品，批號20140110；鏈脲佐菌素(STZ)，Amresco公司產(chǎn)品，批號1262C443； 兔抗大鼠CD34、CD44、CD38多克隆抗體,北京義翹神州科技有限公司產(chǎn)品，型號80262-R02H、53953-M08H、65003-T08H； DAPI 4’,6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚二鹽酸鹽，武漢博士德公司產(chǎn)品，批號40727ES10；Anti-CD34 /FITC熒光素標(biāo)記，上海浩然生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，貨號bsF-0646R；重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)，成都蓉生藥業(yè)有限責(zé)任公司產(chǎn)品，批號S20013036；大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子C(VEGF-C)ELISA檢測試劑盒，上海酶聯(lián)生物科技有限公司產(chǎn)品，貨號ml002952；Trizol總 RNA提取試劑，上海翊圣生物科技有限公司產(chǎn)品，貨號10606ES60；兔抗大鼠CD34-抗Abnova免疫組化試劑盒，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，貨號PAB 18289；DAB試劑盒，北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品，貨號DA1010；高脂飼料、檸檬酸鈉緩沖液、三羥甲基氨基甲烷緩沖液，由黃河科技學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心供應(yīng)；羥乙基淀粉550，上海易佰聚經(jīng)貿(mào)有限公司產(chǎn)品，貨號HES-TBD550。RPM1640 Medium ①Nissui日水培養(yǎng)基、德國Sigma 3K15高速(冷凍)離心機(jī)，購自北京五洲東方科技發(fā)展有限公司； EPICS XL II型流式細(xì)胞儀，美國Beckman Coulter公司產(chǎn)品。

1.3 模型的建立

將健康清潔級雄性SD大鼠80只以高脂飼料喂養(yǎng)4周，禁食12 h，按45 μg/g體質(zhì)量腹腔注射STZ，3 d后測空腹血糖。空腹血糖≥17.9 mmol/L為糖尿病模型成功。第2天用液氮棉簽冷凍大鼠右后肢距離髂棘外側(cè)0.5 cm處約20 s，共冷凍3次。一次冷凍后待皮膚復(fù)溫后再行下次冷凍。冷凍后第2天局部充血水腫范圍擴(kuò)大；第3天水腫范圍局限化，皮膚顏色變暗紅色，第5天形成潰瘍。選取Wagner[3]分級3級的動(dòng)物入實(shí)驗(yàn)組。

1.4 動(dòng)物分組與給藥

1.4.1 外周血干細(xì)胞的制備

40只實(shí)驗(yàn)大鼠，皮下注射G-CSF 500 ng/g，1次/d，連續(xù)5 d，給藥期間皮下注射肝素抗凝4 100 u/kg，1次/d。以質(zhì)量分?jǐn)?shù)200 g/L的 烏拉坦0.3 μL/g體質(zhì)量腹腔麻醉，腹主動(dòng)脈采血，采用密度梯度法離心外周血單核細(xì)胞：將細(xì)胞懸液在300 g離心力下離心10 min，吸取上層單核細(xì)胞層，加入2倍緩沖液；200 g離心力下離心15 min，完全吸去上清；用80 μL的緩沖液/107個(gè)細(xì)胞重新懸浮細(xì)胞，加入CD38、CD34、CD44微珠每20 μL/7.8×107個(gè)細(xì)胞，混勻；在4～8 ℃孵育15 min；加入1～2 mL/107個(gè)細(xì)胞緩沖液洗滌細(xì)胞，在300 g離心力下離心10 min；完全棄掉上清，加入0.5 mL緩沖液懸浮細(xì)胞進(jìn)入磁性篩選。分選細(xì)胞前用0.5 mL緩沖液沖洗柱子，將細(xì)胞懸液加到柱子中，用適量緩沖液3次沖洗柱子，每次都要抽空柱池，將分選柱與分選磁鐵分離，放在收集管中；向柱子中加入0.5 mL緩沖液，分選柱塞快速推下，收集得到干細(xì)胞。加入無菌的DAPI溶液0.1 mL染色，避光，室溫下靜止15 min，加入2倍緩沖液，在200 g離心力下離心15 min ，丟棄上清部分。RPM1640培養(yǎng)基上稀釋4 mL [干細(xì)胞濃度(0.5～2.0)×106/mL]，在冰上保存并計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)。在紫外波長下發(fā)藍(lán)色熒光為標(biāo)記細(xì)胞的細(xì)胞核，收集干細(xì)胞，以備移植。

1.4.2 分組與給藥

將造模成功的60只大鼠隨機(jī)分為模型對照組、外周血干細(xì)胞組、活血生肌湯+外周血干細(xì)胞組，每組20只。活血生肌湯+外周血干細(xì)胞組以活血生肌湯 0.8 g/kg灌胃，給藥體積為10 μL/(g·d)，2次/d。外周血干細(xì)胞組、活血生肌湯+外周血干細(xì)胞組在距離足潰瘍1 mm邊緣等距4個(gè)位點(diǎn)處，一次性皮下內(nèi)膜層注射0.1 mL細(xì)胞懸液于小腿肌肉內(nèi)，進(jìn)針深度1 cm，兩注射位點(diǎn)間距0.5 mm，每個(gè)位點(diǎn)注射0.1 mL細(xì)胞懸液。 模型對照組、外周血干細(xì)胞組灌服等體積的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5 g/L 的羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)溶液。各組連續(xù)灌胃30 d。

1.5 檢測指標(biāo)

1.5.1 VEGF水平

實(shí)驗(yàn)結(jié)束，禁食12 h后腹主動(dòng)脈取血，4 ℃靜置1 h， 3 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心20 min，取上清分別裝于EP管，置于20 ℃冷凍保存。采用ELISA法檢測血清VEGF水平，操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。設(shè)立標(biāo)準(zhǔn)品的檢測濃度，以酶標(biāo)儀自動(dòng)擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測待測孔的OD值。

1.5.2 局部潰瘍VEGF mRNA表達(dá)

采用實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄PCR檢測方法，操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.5.3 免疫組織化學(xué)檢測CD34的表達(dá)

采用SP免疫組織化學(xué)染色方法 ，操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.5.4 潰瘍局部組織CD34、CD44、CD38蛋白表達(dá)

采用免疫蛋白印記法檢測方法，操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.5.5 潰瘍面愈合

采用免疫組化檢查潰瘍面愈合情況

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

外周血干細(xì)胞組、活血生肌湯+外周血干細(xì)胞組大鼠因灌胃操作不當(dāng)各死亡1只。

2.1 各組大鼠血清VEGF、潰瘍局部組織中VEGF mRNA表達(dá)對比

與模型對照組對比，外周血干細(xì)胞組血清VEGF水平、潰瘍局部組織中VEGF mRNA表達(dá)不明顯(P>0.05)；活血生肌湯+外周血干細(xì)胞組的血清VEGF水平、潰瘍局部組織中VEGF mRNA表達(dá)均增加，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與外周血干細(xì)胞組對比，活血生肌湯+外周血干細(xì)胞組血清VEGF水平增加(P<0.05)、潰瘍局部組織VEGFmRNA表達(dá)顯著增加(P<0.01)。見表1。

組別n血清VEGF潰瘍局部組織中VEGFmRNA模型對照組2027．42±3．540．27±0．04外周血干細(xì)胞組1932．43±1．0?0．38±0．09?活血生肌湯+外周血干細(xì)胞組1954．06±7．61???##0．68±0．12???###

注：與模型對照組對比，*P>0.05，***P<0.01；與外周血干細(xì)胞組對比，##P<0.05，###P<0.01

2.2 各組大鼠潰瘍局部組織CD34、CD44、CD38蛋白表達(dá)對比

與模型對照組對比，外周血干細(xì)胞組的CD44表達(dá)變化不明顯，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，CD34、CD38表達(dá)升高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；活血生肌湯+外周血干細(xì)胞組局部潰瘍組織CD34、CD44、CD38表達(dá)升高(P<0.01)。與外周血干細(xì)胞組對比，活血生肌湯+外周血干細(xì)胞移植組CD34、CD44、CD38表達(dá)升高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

組別nCD34CD44CD38模型對照組200．38±0．200．24±0．020．31±0．01外周血干細(xì)胞組190．83±0．01??0．29±0．01?0．46±0．01??活血生肌湯+外周血干細(xì)胞組191．00±0．08???##0．66±0．04???##0．79±0．08???##

注：與模型對照組對比，*P>0.05，**P<0.05，***P<0.01；與外周血干細(xì)胞組對比， ##P<0.05

2.3 各組大鼠潰瘍面愈合對比

各組潰瘍面長徑、短徑均較治療前縮小。與模型對照組對比，外周血干細(xì)胞組、活血生肌湯+外周血干細(xì)胞組潰瘍面的長徑、短徑均縮小，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。與外周血干細(xì)胞組對比，活血生肌湯+外周血干細(xì)胞組潰瘍面的長徑、短徑均縮小，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表3。

組別n治療前長徑短徑治療30d長徑短徑模型對照組203．72±0．712．63±0．711．14±0．410．82±0．41外周血干細(xì)胞組193．41±0．822．43±0．420．84±0．23???0．61±0．16??活血生肌湯+外周血干細(xì)胞組193．68±0．922．73±0．620．14±0．12???###0．11±0．10???###

注：治療30 d后，與模型對照組對比，**P<0.05，***P<0.01；與外周血干細(xì)胞組對比， ###P<0.01

3 討 論

目前認(rèn)為糖尿病足發(fā)生的3個(gè)要素是血管閉塞性缺血、感染和神經(jīng)病變[4]。本實(shí)驗(yàn)采用高脂飼料+低劑量 STZ復(fù)制糖尿病模型，然后采用液氮棉簽冷凍法復(fù)制大鼠糖尿病足潰瘍模型是基于：長期高脂可以誘發(fā)脂肪、糖代謝紊亂，形成動(dòng)脈粥樣硬化；低劑量STZ損傷胰島B細(xì)胞，加速糖尿病形成；低溫液氮棉簽冷凍引起下肢局部血流減少，損傷局部組織，導(dǎo)致潰瘍形成，誘發(fā)炎癥反應(yīng)，可在糖尿病的基礎(chǔ)上形成均一的足潰瘍[5-6]。干細(xì)胞移植治療糖尿病足潰瘍的基礎(chǔ)理論是因干細(xì)胞具有分化能力，可分化成血管內(nèi)皮祖細(xì)胞和成血管細(xì)胞，這些細(xì)胞可以促進(jìn)新生毛細(xì)血管形成，從而改善血液供應(yīng)。移植后的造血干細(xì)胞不僅是血液中各種血細(xì)胞的原祖細(xì)胞，也是血液循環(huán)過程中內(nèi)皮細(xì)胞的來源。研究證明干細(xì)胞促進(jìn)血管生成的機(jī)制包括：①分化成血管平滑肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞；②直接形成新的血管；③通過旁分泌形成Ang-I、Ang-II、VEGF等多種血管生成因子，促進(jìn)血管新生[7-9]。

本研究結(jié)果顯示：治療30 d后，活血生肌湯+外周血干細(xì)胞組大鼠血清VEGF和潰瘍局部組織中VEGF mRNA表達(dá)較模型對照組增加(P<0.01)。與模型對照組比，干細(xì)胞組CD44蛋白表達(dá)不明顯(P>0.05)，而CD38、CD34蛋白表達(dá)增加(P<0.05)；活血生肌湯+外周血干細(xì)胞組CD38、CD34、CD44蛋白量表達(dá)顯著增加(P<0.01)。外周血干細(xì)胞組、活血生肌湯+外周血干細(xì)胞組大鼠潰瘍面較模型對照組縮小(P<0.05或P<0.01)?；钛?lián)合外周血干細(xì)胞移植可顯著增加潰瘍局部組織中VEGF mRNA表達(dá)，增加局部潰瘍組織CD38、CD34、CD44蛋白表達(dá)，促進(jìn)新生血管形成及潰瘍創(chuàng)面的愈合。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為：由于瘀阻于四肢脈絡(luò)，氣血不能濡養(yǎng)肌肉筋骨而出現(xiàn)肢體麻疼或肢端壞疽?；钛窃谥嗅t(yī)藥理論指導(dǎo)下、結(jié)合現(xiàn)代藥理學(xué)研究篩選而成的治療糖尿病足的中藥方劑。方中丹參、紅花、赤芍具有活血化瘀、止痛通絡(luò)作用；乳香善于調(diào)氣，能活血定痛，消腫生??；川芎具有祛風(fēng)、止痛活血行氣的功效；生黃芪、黨參、生地黃具有養(yǎng)血生津、活血行氣止痛作用，其中黨參益氣養(yǎng)血生津，生黃芪益氣固表、利水、排膿生肌、托瘡，生地黃滋陰清熱；黃柏清熱解毒，瀉火燥濕；大黃瀉火解毒、活血祛瘀。全方共奏通絡(luò)止痛、活血祛瘀、解毒生肌、益氣生津之效。本研究通過灌胃大鼠、調(diào)節(jié)機(jī)體而發(fā)揮上述作用，證實(shí)了活血生肌湯對干細(xì)胞移植治療糖尿病足具有增強(qiáng)療效的作用，此與該方具有清熱解毒、活血行氣止痛通絡(luò)、祛瘀生新的功效有關(guān)，其可促進(jìn)干細(xì)胞移植后血管新生，促進(jìn)側(cè)支循環(huán)的建立，但其作用機(jī)制有待深入研究。

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