血管緊張素轉化酶2對肝細胞凋亡的影響

宋麗妮 曹 曦 劉 薇 楊金奎*

(1.首都醫(yī)科大學附屬北京同仁醫(yī)院內分泌科，北京 100730；2.糖尿病防治研究北京市重點實驗室，北京 100730)

腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system, RAS)在冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(以下簡稱冠心病)、糖尿病心肌病及糖尿病腎病中起重要作用。ACE2-Ang-(1-7)-MAS軸作為新發(fā)現(xiàn)的 RAS 調節(jié)軸, 可拮抗經典軸ACE/AngⅡ/AT1(Ang Ⅱ type 1 receptor)的生物效應[1]。近年來，研究[2]顯示肝細胞的異常凋亡與各種急、慢性肝病的發(fā)生、發(fā)展和預后以及肝臟惡性腫瘤的形成密切相關。肝臟作為胰島素作用的主要靶器官，同時也是脂代謝的重要器官，對于機體糖脂代謝的調節(jié)起著十分重要的作用，肝細胞的過度凋亡，可嚴重影響肝臟功能，從而引起或加重糖、脂代謝紊亂。目前，有研究[3-7]表明ACE2過表達可以改善氧化應激、炎性反應以及內質網應激等，從而減少小鼠胰島細胞[3]與肺內皮細胞[4]、大鼠視網膜內皮細胞[5]、人臍靜脈內皮細胞[6]以及心肌細胞[7]的凋亡，但其對肝細胞的生長與凋亡的影響及具體機制尚不明確。本文將通過以棕櫚酸處理人肝癌細胞(HepG2 cell)誘導凋亡的細胞模型探討ACE2對肝細胞生長和凋亡的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

8周齡雄性野生型C57BL/6小鼠，體質量18～24 g，購自北京維通利華實驗動物中心，實驗動物許可證號：SCXK(京) 2016-0011，ACE2-/y小鼠由Prof. Dr. Josef Penninger from Institute for Molecular Biotechnology GmbH教授饋贈。實驗所使用的所有動物均經過首都醫(yī)科大學附屬北京同仁醫(yī)院動物委員會批準，SPF級別動物房飼養(yǎng)。

1.2 細胞培養(yǎng)

人肝癌細胞株HepG2 細胞購自中國協(xié)和醫(yī)科大學細胞資源中心(Cell Resource Center, IBMS, CAMS /PUMC)，用含10%(體積分數)胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的DMEM 進行體外培養(yǎng)(100 U/mL青霉素和0.1 mg/mL鏈霉素)，調整細胞密度為 2×105個/mL， 分別接種于96 孔板、6孔板，置37 ℃ 、5% (體積分數)CO2飽和濕度的 CO2孵箱內培養(yǎng)。 HepG2 細胞在Ad-rACE2-eGFP[adenovirus coding for rat ACE2 (rACE2) upstream of an enhanced green florescent protein，購自Sino-GenoMax, China]病毒(1.0×107pfu/mL)或對照Ad-eGFP(adenovirus of an enhanced green florescent protein)病毒(1.0×107pfu/mL)孵育24 h后熒光顯微鏡觀察病毒感染效率。

1.3 細胞活性檢測(MTT)法

以不同濃度(0、0.25、0.4、0.8、1.0 mmol/L)棕櫚酸[8]分別處理已感染ACE2腺病毒或GFP病毒的HepG2細胞，于各組中(96孔培養(yǎng)板)加入MTT[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazoliumbromide, 美國Sigma公司]10 μL置37 ℃孵箱孵育4 h，用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline, PBS)洗滌兩次，每孔加150 μL 二甲基亞砜(DMSO, 美國Sigma公司)，振蕩，孵育30 min，置多功能酶聯(lián)免疫檢測儀上測每孔570 nm 吸光度值。

1.4 TUNEL法檢測肝細胞凋亡

采用北京全式金生物公司(TransGen Biotech)提供的TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒測定同周齡雄性ACE2-/y和C57BL/6小鼠肝臟中的細胞凋亡情況。具體步驟嚴格按說明書進行操作。高倍熒光顯微鏡(Leica)隨機選取4個視野進行觀察，與細胞核重疊并且發(fā)綠光的為陽性細胞，即凋亡肝細胞。

1.5 RNA 的提取和實時定量 RT-PCR

應用Trizol法抽提HepG2細胞總RNA(Invitrogen公司，美國)，以2 mg RNA 為模板利用Rever TraAceqPCR RT試劑盒(Toyobo 公司，日本) 反轉出cDNA。利用ABI GeneAmp 5700PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems公司，美國)，SYBR Green PCR master mix反應液檢測RNA 的表達。 經分析系統(tǒng)進行相關表達的定量。 引物序列如表1。

1.6 Western blotting

在4 ℃條件下，加入裂解液提取HepG2細胞蛋白。用BCA蛋白分析試劑盒測定樣品蛋白濃度。每個樣本取30 ～ 60 μg蛋白進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride, PVDF)上，用含5% (質量分數)脫脂奶粉的TBST[TBS+0.1%(質量分數)Tween-20]溶液封閉1.5 h，用封閉液將一抗按照一定比例稀釋(抗Bcl-2、Bax、caspase-3、cleaved-caspase-3、JNK、P-JNK、CHOP、beta-actin抗體均購自Cell signaling technology，抗ACE2抗體購自美國Santa Cruz公司)，將膜與一抗4 ℃搖床孵育過夜。次日TBST漂洗3次，每次5 min，再與辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)標記的二抗(1∶2 000)室溫孵育1 h，TBST漂洗3次，每次10 min，以肌動蛋白(beta-actin)作為內參，滴加增強化學發(fā)光(enhanced chemiluminescence, ECL)發(fā)光液后用Chemi-Doc Touch凝膠成像系統(tǒng)顯影成像，并用Image J軟件對圖像進行灰度分析。分別計算出Bcl-2、Bax、caspase-3、cleaved-caspase-3、JNK、P-JNK和CHOP與內參beta-actin的吸光度積分值之比分別作為其相對含量值。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.7 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 ACE2載體感染HepG2細胞

將Ad-rACE2-eGFP和Ad-eGFP分別感染HepG2細胞，24 h后觀察綠色熒光蛋白表達情況。兩種GFP熒光均有明顯表達，兩種腺病毒均成功感染HepG2細胞(圖1A)。采用Western blotting檢測ACE2蛋白在HepG2細胞中的表達，ACE2蛋白在HepG2細胞中有表達，GFP組相較正常對照組ACE2的表達有增長趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。而HepG2細胞經ACE2腺病毒感染的ACE2組相較于control組和GFP組其ACE2蛋白的表達顯著增加，其中ACE2組相較于GFP組其ACE2蛋白的表達明顯增加且差異有統(tǒng)計學意義 (P<0.05，圖1B)。

2.2 ACE2改善了棕櫚酸誘導的HepG2細胞的凋亡

HepG2細胞在轉染Ad-rACE2-eGFP或Ad-eGFP后以不同濃度棕櫚酸處理24 h。MTT結果顯示，兩組隨著棕櫚酸濃度的增加細胞活性均逐漸下降，當棕櫚酸濃度分別為0.4、0.8、1.0 mmol/L時過表達ACE2的HepG2細胞活性明顯高于對照GFP組，差異有統(tǒng)計學意義。其中棕櫚酸濃度為0.4 、1.0 mmol/L時(P<0.05)，棕櫚酸濃度為0.8 mmol/L時過表達ACE2組較對照GFP組其細胞存活率顯著增加(P<0.001)，詳見圖2。

2.3 ACE2敲除小鼠肝細胞凋亡增多

同周齡成年雄性ACE2敲除小鼠的肝臟石蠟切片經TUNEL染色結果顯示，其凋亡細胞數明顯多于野生型C57BL/6小鼠(圖3)。ACE2基因的敲除增加了肝細胞的凋亡。

2.4 ACE2對凋亡及內質網應激相關基因表達的影響

將ACE2過表達于HepG2細胞后，采用RT-PCR方法檢測凋亡及內質網應激相關基因水平的表達。ACE2過表達HepG2細胞后，與對照GFP組相比，抗凋亡基因Bcl-2的mRNA明顯升高，而促凋亡基因Bax、caspase-3、caspase-12的mRNA均顯著降低，ACE2有抑制細胞凋亡的作用(圖4A)。與此同時，內質網應激凋亡通路相關IRE1a、Xbp1、PERK、ATF6、GRP78、CHOP、GADD34的mRNA水平均顯著降低圖4B。

2.5 ACE2對凋亡通路相關蛋白表達的影響

將ACE2過表達于HepG2細胞后，檢測凋亡通路相關蛋白(Bcl-2、Bax、caspase-3、cleaved-caspase-3、P-JNK、JNK、CHOP)的表達。Western blotting分析結果顯示，經PA處理的3組之間總的caspase-3和JNK的表達均無差異。同時，經PA處理的GFP組相較于正常對照組Bcl-2、Bax、P-JNK以及CHOP的表達無差異，其中cleaved-caspase-3有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義。而ACE2組與GFP組比較，抗凋亡Bcl-2蛋白表達明顯升高，其凋亡通路相關基因Bax、cleaved-caspase-3、P-JNK、CHOP蛋白水平顯著降低(圖5，P<0.05)。

圖2 MTT法檢測不同處理下細胞活性Fig.2 MTT assay measuring cell viability in HepG2 cells

3 討論

糖尿病作為一種以自身胰島素分泌不足和胰島素抵抗為主要特征的疾病，發(fā)病率逐年升高。肝臟作為糖脂代謝的主要器官，肝臟胰島素抵抗被認為是2 型糖尿病的主要原因之一，并且在糖尿病不斷發(fā)展的過程中也同樣會導致一系列的肝功能損傷，從而形成惡性循環(huán)[9]。所以，肝細胞的正常代謝與生長狀態(tài)直接影響著機體的糖脂代謝平衡。本課題組[3]的前期研究表明，ACE2基因敲除的小鼠表現(xiàn)為糖耐量受損及胰島素分泌功能障礙，而ACE2的上調可以通過減少胰島細胞的氧化應激與凋亡從而對胰島素分泌起到保護作用。筆者研究結果表明，ACE2敲除小鼠肝臟中凋亡的肝細胞明顯增多，而在棕櫚酸處理下經ACE2過表達載體轉染的HepG2細胞活力顯著增高。所以，ACE2與肝細胞凋亡之間存在一定的聯(lián)系，并且ACE2基因敲除小鼠表現(xiàn)的糖耐量受損很可能與肝細胞凋亡增多有關。

圖3 細胞原位TUNEL法(綠色)檢測肝細胞的凋亡Fig.3 Liver cell apoptosis detected by TUNEL(green)

圖4 ACE2對凋亡及內質網應激相關基因表達的影響Fig.4 Effect of ACE2 on apoptosis and endoplasmic reticulum stress-related gene expression

棕櫚酸可以對細胞產生脂毒性從而引起內質網應激和細胞凋亡[10]。在內質網應激(endoplasmic reticulum stress, ERS)早期，ER通過減少蛋白合成以及降解蓄積的錯誤折疊或未折疊蛋白質來維持細胞正常功能，但當ERS過強或持續(xù)時間過久，細胞通過激活非折疊蛋白反應(unfold protein response, UPR)[11]，繼而誘導ERS下游C-Jun氨基酸末端激酶(JNK)、C/EBP同源蛋白(CHOP)和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶12(caspase-12)基因的表達[12]，最終直接或間接的引起級聯(lián)凋亡反應，激活下游的caspase-3從而引起細胞凋亡[13]。Caspase-3通路是經典的凋亡通路，其表達上調提示細胞凋亡水平的增加[14]。在本研究中，筆者以棕櫚酸處理HepG2細胞誘導凋亡為模型，并以ACE2過表達載體轉染細胞，在此基礎上檢測到內質網應激誘導細胞凋亡的IRE1/JNK/Bax/caspase-3通路，PERK/ATF4/CHOP/caspase-3通路以及caspase-12 基因[15]的表達均顯著降低。該現(xiàn)象表明ACE2可以通過抑制caspase-3通路從而減少凋亡的發(fā)生，其機制可能是ACE2改善了細胞內質網應激的水平，從而降低UPR介導的細胞凋亡通路相關蛋白的表達。

本研究證實了ACE2可以通過改善內質網應激從而減少肝細胞的凋亡，但還存在以下不足：目前的實驗結果為體外實驗，下一步筆者計劃在ACE2敲除小鼠及高脂喂養(yǎng)小鼠模型上進一步觀察ACE2-Ang(1-7)-Mas軸對肝細胞內質網應激及糖脂代謝的影響。目前，ACE2對內質網應激的影響得到證實，但其具體機制還需進一步探討，筆者將在線粒體和內質網方面進行進一步研究。

綜上所述，本研究結果表明，ACE2上調可以減少肝細胞的凋亡，這一過程可能是通過降低內質網應激水平來實現(xiàn)的。本研究結果進一步明確了ACE2在肝細胞生長與凋亡中的調節(jié)作用，并為糖尿病的治療提供了新的線索。

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