PGRMC1在乳腺癌組織中的表達(dá)及其與臨床病理特征的相關(guān)性

王利娟 阮祥燕 趙 越

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院婦科內(nèi)分泌科，北京 100026)

乳腺癌是中國女性最常見的癌癥，中國乳腺癌人數(shù)占全球所有新診斷乳腺癌人數(shù)的12.2%，占全球因乳腺癌死亡人數(shù)的9.6%[1]。隨著人們對更年期認(rèn)識的不斷提高，越來越多的絕經(jīng)前后婦女開始進(jìn)行激素替代治療用于預(yù)防或治療由慢性雌激素缺乏引起的絕經(jīng)相關(guān)癥狀。更年期激素替代治療多采取雌孕激素聯(lián)合治療，用于預(yù)防單獨使用雌激素帶來的子宮內(nèi)膜增生和子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生風(fēng)險。而一些大型臨床研究[2-4]結(jié)果表明，雌孕激素聯(lián)合治療與單獨雌激素治療相比，乳腺癌的發(fā)生風(fēng)險增加了。體外實驗[5-6]證實，合成孕激素可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖，尤其是孕激素受體膜組分1(progesterone receptor membrane component 1, PGRMC1)過表達(dá)乳腺癌細(xì)胞的增生，最新的體內(nèi)實驗[7]結(jié)果也證實了這個觀點。這些體內(nèi)外實驗結(jié)果表明PGRMC1也許在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用。

PGRMC1是一種參與多種細(xì)胞進(jìn)程的多功能蛋白，屬于膜相關(guān)孕激素受體蛋白家族，廣泛存在于真核生物中，能夠結(jié)合并調(diào)節(jié)細(xì)胞色素P450酶(cytochrome p450 enzyme)，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、P4(progesterone, P4)信號通路和類固醇的應(yīng)答[8]。研究[9]顯示，致癌物質(zhì)二噁英更夠使PGRMC1表達(dá)上調(diào)，PGRMC1在一些腫瘤中過表達(dá)，如肺、結(jié)腸、和甲狀腺[10-11]。雖然有研究[12]顯示PGRMC1在正常乳腺組織和乳腺癌組織中有表達(dá)，但PGRMC1表達(dá)水平和乳腺腫瘤的良惡性關(guān)系還未確立。本研究旨在分析PGRMC1和乳腺腫瘤相關(guān)免疫組織化學(xué)指標(biāo)在乳腺癌組織、乳腺良性腫瘤組織和正常乳腺組織中的表達(dá)情況，并評估PGRMC1與這些指標(biāo)的相關(guān)性，探索PGRMC1與乳腺癌發(fā)生風(fēng)險的關(guān)系。

1 對象與方法

1.1 研究對象

納入2015年9月至2017年1月間乳腺癌組織標(biāo)本60例，年齡24～68歲，平均年齡(46.0±6.5)歲。乳腺良性腫瘤30例，正常乳腺組織30例(來自經(jīng)乳腺麥默通微創(chuàng)旋切良性腫瘤周圍1 cm左右的正常組織，病理證實乳腺組織無異常者)，年齡26～64歲，平均年齡(41.0±4.7)歲，來源均為女性患者，分別來自首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院乳腺外科，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院乳腺外科以及陸軍總醫(yī)院263臨床部乳腺外科，所有組織來源者在術(shù)前經(jīng)空心針活檢或經(jīng)術(shù)后病理組織學(xué)檢查確診。納入試驗的患者均已簽署知情同意書。

1)納入標(biāo)準(zhǔn)：乳腺癌：①病理診斷乳腺癌(無論有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)；②無其他惡性腫瘤治療史；③所有患者均未經(jīng)過任何術(shù)前針對性治療；④足夠可利用的組織標(biāo)本。乳腺良性腫瘤：①乳腺纖維腺瘤；②乳腺導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀瘤；③乳腺囊性增生病。

2)排除標(biāo)準(zhǔn)：①男性乳腺癌；②術(shù)前接受任何形式新輔助化學(xué)藥物治療和靶向治療等的患者；③近1個月內(nèi)接受激素替代治療者。

1.2 主要試劑

無水乙醇、二甲苯購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司， PGRMC1 兔抗人單克隆抗體(購自 Abcam 公司， 編號：ab48012，美國)； ER鼠抗人單克隆抗體 (購自Abcam 公司，編號： ab32063，美國)； PR 鼠抗人單克隆抗體(購自Abcam公司，編號：ab2764，美國)； Ki67 兔抗人單克隆抗體 (購自武漢谷歌生物科技有限公司，編號：GB13030)。免疫組織化學(xué)試劑盒DAB顯色劑K5007(購自美國DAKO公司)。蘇木素染液、中性樹膠(購自武漢谷歌生物科技有限公司)。

1.3 免疫組織化學(xué)結(jié)果判定

蘇木素染細(xì)胞核為藍(lán)色，DAB(3, 3′-diaminobenzidine)顯出的陽性表達(dá)為棕黃色。雌激素受體(estrogen receptor, ER)、孕激素受體(progestogen receptor, PR)、Ki-67表達(dá)產(chǎn)物主要為核著色，呈棕黃色或黃褐色分布。PGRMC1、human epidermal growth factor receptor-2 (Her-2)主要定位于細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)，腫瘤細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色或黃褐色均勻顆粒為陽性細(xì)胞。采用組織切片掃描儀(Pannoramic MID, 3D HISTECH)對組織切片進(jìn)行掃描和分析。圖片掃描完成后進(jìn)入Quant center 中的Densito quant軟件自動識別并設(shè)置組織切片上所有的深棕色為強(qiáng)陽性，棕黃色為中度陽性，淺黃色為弱陽性，藍(lán)色細(xì)胞核為陰性。進(jìn)而對每個組織進(jìn)行識別分析出強(qiáng)陽性，中度陽性，弱陽性及陰性的面積(單位：像素)，陽性的百分比。ER、PR及Her-2的免疫組織化學(xué)結(jié)果判讀依據(jù)ASCO-CAP指南[13-14]；PGMC1的結(jié)果判定采用半定量積分法，對組織切片中的染色強(qiáng)度打分，無色為0分，<1/3為1分，1/3～2/3為2分，>2/3為3分；再按照陽性細(xì)胞百分率打分：陽性細(xì)胞<5%為0分，5%～25%為1分，25%～50%為2分，50%～75%為3分，>75%為4分。二者乘積≤2分的定為陰性，>2分的定為陽性。Ki-67僅計數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)，方法同上，評分≤1為陰性，>1為陽性[15]。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS17.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。各免疫組織化學(xué)指標(biāo)的表達(dá)情況比較采用χ2檢驗，相關(guān)性分析采用二分類的Logistic回歸分析并控制相關(guān)混雜因素對PGRMC1結(jié)果的影響，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各免疫組織化學(xué)指標(biāo)在乳腺癌組織、乳腺良性腫瘤組織和正常乳腺組織中的表達(dá)

乳腺癌組PGRMC1的表達(dá)率(68.3%)顯著高于乳腺良性腫瘤組(26.7%)和正常對照組(6.7%)，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。乳腺癌組中ER和Ki-67的表達(dá)率顯著高于乳腺良性腫瘤組和正常對照組，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。PR和Her-2在3組間的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，詳見表1、圖1。

2.2 PGRMC1表達(dá)在乳腺癌和乳腺良性腫瘤組織中與其余各指標(biāo)表達(dá)的相關(guān)性分析

因PGRMC1在正常乳腺組織中的陽性表達(dá)率很低(6.7%)，故只分析其在乳腺癌和乳腺良性腫瘤組織中與其余各指標(biāo)表達(dá)的相關(guān)性。經(jīng)Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組PGRMC1的表達(dá)與ER表達(dá)呈正相關(guān)(OR=3.593，95%CI：1.131～11.418)，與PR、Ki-67和Her-2的表達(dá)無相關(guān)性；乳腺良性腫瘤組PGRMC1的表達(dá)與其他各免疫組織化學(xué)指標(biāo)均無相關(guān)性，詳見表2和表3。

表1 乳腺癌組織、乳腺良性腫瘤組織、正常乳腺組織中各免疫組織化學(xué)指標(biāo)的表達(dá)情況Tab.1 Expression profile of some immunohistochemical indicators in breast cancer tissue, benign breast tumor tissue and normal breast tissue [n(%)]

圖1 PGRMC1在乳腺癌組織和乳腺良性腫瘤組織中的陽性表達(dá) Fig.1 Positive expression of PGRMC1 in breast cancer tissue and benign breast tumor tissue(HE，30×)

表2 PGRMC1表達(dá)在乳腺癌組織中與其余各指標(biāo)表達(dá)的相關(guān)性分析Tab.2 Correlations analysis between the expressions of PGRMC1 and other indicators in breast cancer tissue

表3 PGRMC1表達(dá)在乳腺良性腫瘤組織中與其余各指標(biāo)表達(dá)的相關(guān)性分析 Tab.3 Correlations analysis between the expressions of PGRMC1 and other indicators in benign breast tumor tissue

3 討論

本研究采用免疫組織化學(xué)檢測方法分析了PGRMC1、ER、PR、Ki-67和Her-2在乳腺癌組織、乳腺良性腫瘤組織和正常乳腺組織中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示PGRMC1在乳腺癌組織、乳腺良性腫瘤組織和正常乳腺組織中均有表達(dá)，且乳腺癌組PGRMC1的表達(dá)水平顯著高于其他兩組。關(guān)于PGRMC1在乳腺癌組織、乳腺良性腫瘤組織和正常乳腺組織中的表達(dá)情況，不同研究間結(jié)果差異較大。依據(jù)人類蛋白質(zhì)表達(dá)譜(www.proteinatlas.org)，PGRMC1在正常乳腺上皮組織中表達(dá)強(qiáng)度中等，在大約1/3的被調(diào)查乳腺癌組織中強(qiáng)烈表達(dá)。Crudden等[16]的研究表明，與周圍非惡性組織相比，PGRMC1在乳腺腫瘤組織中過表達(dá)。Ji等[17]的研究發(fā)現(xiàn)正常乳腺組織中沒有PGRMC1的表達(dá)，但免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示PGRMC1在乳腺癌組織中的表達(dá)強(qiáng)弱不等。張穎等[15]研究結(jié)果表明PGRMC1 與常見預(yù)后因子腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、患者疾病復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)期生存情況存在關(guān)聯(lián)， 其很有可能成為乳腺癌患者預(yù)后的獨立預(yù)測因子。而另一RelqPCR(relative quantitative polymerase chain reaction, RelqPCR)結(jié)果[18]顯示PGRMC1的mRNA水平和乳腺癌患者年齡呈負(fù)相關(guān)。導(dǎo)致這些不同結(jié)果的原因可能是因為檢測方式不同，或者和種族有關(guān)。為了整合PGRMC1在乳腺癌組織、乳腺良性腫瘤組織和正常乳腺組織中的表達(dá)情況，明確表達(dá)關(guān)系，需要在更多的國家采取相同檢測方式做更多的研究。

之前的研究[5-7]結(jié)果體現(xiàn)了PGRMC1在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的重要作用，而Marina等[19]的研究結(jié)果顯示乳腺腫瘤組織PGRMC1高表達(dá)的患者相較于低表達(dá)的患者對以蒽環(huán)類為基礎(chǔ)的化療反應(yīng)差。此結(jié)果表明，PGRMC1還可能在人類乳腺癌的進(jìn)展和治療中起著重要作用，并可能成為抗癌治療的目標(biāo)。紀(jì)術(shù)峰[20]的研究還顯示PGRMC1參與了乳腺癌細(xì)胞增生及化療敏感性的調(diào)控。鑒于ER是他莫昔芬極其相似藥物的靶點，ER狀態(tài)是乳腺癌的一個重要生物指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示乳腺癌中PGRMC1的表達(dá)和ER呈正相關(guān)，此結(jié)果和之前的研究[15]結(jié)果一致，但是和Neubauer等[21]的研究結(jié)果相反，后者的結(jié)果表明ER陰性的乳腺癌組織中PGRMC1的表達(dá)水平較高，而PGRMC1在ER陽性表達(dá)的腫瘤組織中被磷酸化，這些結(jié)果表明PGRMC1可能是乳腺癌組織中ER狀態(tài)的一個生物標(biāo)志物。有研究[22]還分析了PGRMC1在三陰乳腺癌組織中的表達(dá)情況，PGRMC1在三陰乳腺癌中的表達(dá)率為55.6%，且與腫瘤轉(zhuǎn)移、臨床分期以及Ki-67 的表達(dá)呈正相關(guān)。本研究未見PGRMC1表達(dá)和Ki-67有相關(guān)性。研究結(jié)果差異可能和樣本量有關(guān)，后續(xù)擴(kuò)大樣本量的研究十分有必要。在乳腺良性腫瘤中未發(fā)現(xiàn)PGRMC1的表達(dá)和其他免疫組織化學(xué)指標(biāo)有相關(guān)性。目前關(guān)于PGRMC1表達(dá)狀態(tài)與乳腺癌相關(guān)免疫組織化學(xué)指標(biāo)的關(guān)系尚未形成統(tǒng)一，需進(jìn)一步擴(kuò)大研究。

國內(nèi)外對PGRMC1在乳腺癌中的表達(dá)及其促乳腺癌發(fā)生、發(fā)展機(jī)制的研究較少，鑒于PGRMC1在體內(nèi)外實驗中對乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的影響，開展關(guān)于PGRMC1的研究將對乳腺癌的預(yù)防、治療和預(yù)后有重要意義。

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