MPTP誘導的食蟹猴偏側帕金森病模型運動行為學的長期動態(tài)評價研究

羅斌斌 胡亞松 岳 峰,2 陳 彪,2*

(1.廣西醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院轉化醫(yī)學研究中心 長壽與老年相關疾病教育部重點實驗室，南寧 530000; 2.首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院神經(jīng)生物學研究室，北京 100053)

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一種常見于老年人的以肢體運動障礙為臨床特征的神經(jīng)變性疾病[1-3]，全人群患病率大約在0.3%[4]，伴隨年齡的增加而發(fā)病率呈上升趨勢[2, 5]， 65歲以上人群患病率約是1～2%[3]。PD疾病發(fā)展表現(xiàn)出慢性進行性加重的特點[6]，主要病因和病理機制是在衰老、遺傳和環(huán)境因素共同作用下，中腦黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元進行性丟失引起黑質(zhì)紋狀體多巴胺的下降[7]。

20世紀80年代中期研究者[8-9]發(fā)現(xiàn)化合物1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP)轉變?yōu)槎拘晕镔|(zhì)后可以透過血-腦脊液屏障，然后被多巴胺能神經(jīng)元胞體攝取，聚集于線粒體后抑制呼吸鏈ATP合成，導致氧化應激損傷，進而引發(fā)多巴胺能神經(jīng)細胞凋亡。MPTP是目前公認的可導致模擬人類PD癥狀的神經(jīng)毒性的物質(zhì)[10]。當前PD模型實驗大多來自于嚙齒類低等動物，高等動物模型較少[5-6, 11]，非人靈長類動物具有許多與人類高度相似的生理學特征，MPTP誘導建立的猴帕金森病模型具有典型代表性[12]，無論是臨床癥狀的變化,還是病理和生物化學指標的改變都與人類原發(fā) PD 十分相似，是進行 PD模型研究中的“金標準”[13]。MPTP誘導的模型包括肌肉注射誘導的全身模型和頸內(nèi)動脈注射誘導的偏側模型，前者運動癥狀明顯持續(xù)，但因生活無法自理，容易死亡，無法開展長期實驗，而后者可利用非受累側肢體取食，生活質(zhì)量影響不大，但同時，運動癥狀變化能否持久相關研究較少。本課題組利用由研究者判斷的臨床評分和24 h軀體自發(fā)運動總量監(jiān)測兩個指標評價頸內(nèi)動脈注射MPTP誘導的偏側PD模型長期運動癥狀動態(tài)變化。

1 材料與方法

1.1 研究對象

本次實驗動物由廣西南寧靈康賽諾科生物科技有限公司[以下簡稱靈康公司，SYXK(桂)2014-0004]提供，實驗室獲得國際實驗動物評估和認可委員會(Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care，AAALAC)認證。本研究實驗方案經(jīng)實驗動物倫理委員會審核并批準實行(AAALAC：WD-0272009)，本研究在靈康公司靈長類動物實驗室進行，選取正常雄性食蟹猴(cynomolgus monkeys)作為本研究的實驗對象。動物環(huán)境溫度23～27 ℃，濕度40%～75%，12 h/12 h光暗交替(7點開燈，19點關燈)。動物早晚飼喂靈長類動物飼料[國家標準(GB)14924.8-2001]，午餐提供水果蔬菜， 24 h為動物提供不限量的經(jīng)反滲透過濾后的安全飲用水。

1.2 方法

1.2.1 主要儀器和試劑

軀體自發(fā)運動總量(physical activity monitoring，PAM)監(jiān)測器(美國Mini Mitter公司)，便攜式錄像機(日本Sony公司)，MPTP(美國Sigma公司)。

1.2.2 MPTP誘導食蟹猴偏側帕金森病模型的建立

5只雄性食蟹猴年齡(5.80±0.44)歲，體質(zhì)量(5.90±0.86)kg，術前禁食12 h以上，常規(guī)麻醉，氯胺酮(0.1 mL /kg)肌注，術中持續(xù)異氟烷1%～3%(體積分數(shù))吸入麻醉。將裝有 60 mL 5%(質(zhì)量分數(shù))MPTP 溶液的注射器安裝在MPTP注射泵上，以4 mL/min的速度開始于食蟹猴左側頸總動脈末段注射 MPTP。MPTP 溶液注射(按照2 mg/kg體質(zhì)質(zhì)量)完畢后，逐層縫合頸闊肌、頸前筋膜、皮下組織及皮膚。

1.2.3 臨床評分

將動物轉移至錄像單籠，分別于MPTP注射前(基線)，注射后3、6個月及1、3、6年于清醒狀態(tài)下進行行為錄像1 h，通過結合Kulran(1991)非人靈長類動物帕金森病模型臨床評分量表[14]對錄像中表現(xiàn)出的臨床癥狀進行雙盲評分。評分內(nèi)容包括：面部表情(0～3分)、靜止性震顫(0～3分)、動作性或意向性震顫(0～3分)、姿勢(0～2分)、步態(tài)(0～3分)、運動徐緩(全身)(0～4分)、平衡與協(xié)調(diào)(0～3分)、總體運動技能(上肢)(0～3分)、總體運動技能(下肢)(0～3分)、防御反應(0～2分)。最小分值為0分，即正常行為為0分，總分最高為29分，即最為嚴重。

1.2.4 軀體自發(fā)運動總量監(jiān)測

軀體自發(fā)運動總量的監(jiān)測主要包括：硬件設備中可以記錄運動數(shù)據(jù)的實時活動PAM監(jiān)測器，數(shù)據(jù)發(fā)送、接收的專用讀取器ActiReader以及進行數(shù)據(jù)分析的Actical Software 3.0 軟件。將PAM監(jiān)測器佩戴于動物頸部，監(jiān)測時間點為MPTP注射前，注射后3、6個月及1、6年。每次佩戴結束后取下PAM監(jiān)測器，利用ActiReader進行數(shù)據(jù)讀取，通過Actical Software 3.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析和整理。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 MPTP誘導的食蟹猴偏側PD模型

結合Kulan 帕金森臨床評分量表[14]來評判MPTP誘導的偏側PD模型成功與否，造模前基線臨床評分均為0分，造模后3個月內(nèi)臨床評分穩(wěn)定在10 分以上可作為偏側PD模型成功構建的指標。對5只食蟹猴進行行為觀察，造模后2周開始出現(xiàn)精神萎靡、瞌睡、疲倦等急性期反應；4周開始出現(xiàn)PD臨床癥狀，主要有運動緩慢、右側肢體運動能力降低、屈曲身體以及攀爬能力下降，臨床癥狀隨時間不斷加重；第5周臨床評分>10分；3個月臨床評分(14.65±8.41)最高，出現(xiàn)明顯偏側PD運動障礙表現(xiàn)，包括總體活動減少，面部表情僵硬(面具臉)，運動徐緩，右上肢活動降低和右手震顫，右下肢運動減少，防御反應減弱，步態(tài)搖晃，身體平衡能力下降，以及不能進行攀爬，表明成功構建偏側PD模型。

2.2 食蟹猴偏側PD模型臨床評分的長期動態(tài)評價

與造模后3個月臨床評分(14.65±8.41)相比，造模后6個月(8.10±2.0)較基線仍明顯增高，但與3個月高峰相期相比顯著降低，造模后1年(7.15±1.48)、3年(4.65±1.01)、6年(4.90±1.94)均較3個月高峰期明顯下降，但與造模后6個月的評分相比，差異無統(tǒng)計學意義(圖1)，成模半年后臨床癥狀趨于平穩(wěn)(5分左右)，并維持至少6年。時間累積對臨床評分的影響存在顯著性(F=5.930，P<0.005)。

分別針對評分量表中的震顫(tremor)、防御反應(defense reaction)、平衡(balance)、姿勢(posture)、步態(tài)(gait)、右上肢運動技能(right upper limb motor skills)、右下肢運動技能(right lower limb motor skills)、運動遲緩(bradykinesia)8個評分要素進行獨立分析，成模后臨床評分減低的先后順序依次為：震顫>防御反應>平衡>姿勢>步態(tài)>右下肢運動技能>右上肢運動技能>運動遲緩。這些癥狀均在3個月達到頂峰，隨后改善，其中震顫6個月時基本消失，而右側肢體的運動幅度和速度以及運動遲緩在造模后6年仍存在顯著障礙，防御反應、平衡、姿勢和步態(tài)改善較明顯(圖2)。

2.3 食蟹猴偏側PD模型軀體自發(fā)運動總量的變化

造模后3個月24 h軀體自發(fā)運動總量(16 597.79±12 488.87)較造模前基線(50 084.20±30 170.89)明顯降低(P=0.014)。造模后6個月24 h軀體自發(fā)運動總量(29 278.02±12 264.66)較3個月時有明顯恢復(P=0.016)，但仍顯著低于基線。造模后1年至6年24 h軀體自發(fā)運動總量變化與基線相比差異無統(tǒng)計學意義(圖3)。時間累積對24 h軀體自發(fā)運動總量的影響并不明顯(F=2.850，P>0.05)。

圖1 食蟹猴偏側PD模型造模前基線、造模后3、6個月及1、3、6年臨床評分的比較Fig.1 Comparing the clinical scores before and after the modeling of the hemi-Parkinsonian’s model of cynomolgus monkeys at 3, 6 months and 1, 3, and 6 years after modeling

圖2 食蟹猴偏側PD模型造模前基線、造模后3、6個月及1、3、6年臨床評分中各評分要素評分均值的變化Fig.2 Comparing the clinical scores before and after the modeling of the hemi-parkinsonian’s model of cynomolgusmonkeys at 3, 6 months and 1, 3, and 6 years after modeling

圖3 食蟹猴偏側PD模型造模前基線、造模后3、6個月及1、6年全天24 h軀體自發(fā)運動總量的變化Fig.3 Comparing the 24 h physical activity before and after the modeling of the hemi-parkinsonian’s model of cynomolgus monkeys at 3, 6 months and 1, 6 years after modeling

造模后3個月晝光(12 h)軀體自發(fā)運動總量 (14 814.19±12 707.49)較基線(45 743.90±28 587.57)下降明顯(P=0.014)。造模后6個月晝光(12 h)軀體自發(fā)運動總量仍較基線明顯降低(P=0.016)，但造模后1年至6年晝光(12 h)軀體自發(fā)運動總量變化與基線相比差異無統(tǒng)計學意義(圖4)。時間累積對晝光(12 h)軀體自發(fā)運動總量的影響并不明顯(F=2.850，P>0.05)。

圖4 食蟹猴偏側PD模型造模前基線、造模后3、6個月及1、6年晝光和夜光軀體自發(fā)運動總量的比較Fig.4 Comparing the physical activity in day-12 h andnight-12 h before and after the modeling of the hemi-parkinsonian’s model of cynomolgus monkeys at 3 months, 6 months and 1, and 6 years after modeling

造模后3個月夜光(12 h)軀體自發(fā)運動總量(1 783.61±676.08)較基線(4 340.30±2 464.01)顯著減少，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.026)。造模后6個月夜光(12 h)軀體自發(fā)運動總量減少有明顯恢復，但仍較術前基線減少，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.028)，造模后1年至6年夜光(12 h)軀體自發(fā)運動總量變化與基線相比差異無統(tǒng)計學意義(圖4)。長時間的累積對夜光(12 h)軀體自發(fā)運動總量有著顯著的影響(F=3.020，P<0.05)。

3 討論

在MPTP誘導靈長類動物PD模型猴的研究中，除Domino等[15]對PD模型猴進行3年的藥效研究和Emborg-Knott等[16]進行了6至8年的藥效與行為觀察，鮮有進行長期的運動行為學動態(tài)評價研究，尤其是偏側模型。相比影像學研究[17-19]和病理學研究[20-21]，本課題組首次結合臨床評分和軀體自發(fā)運動總量的監(jiān)測，來評價臨床癥狀的發(fā)展變化，實現(xiàn)無創(chuàng)、經(jīng)濟的靈長類PD模型運動行為學的長期動態(tài)研究。

本研究制備的MPTP誘導食蟹猴偏側PD模型注射后2周開始出現(xiàn)急性期非特異性全身反應，4周開始出現(xiàn)PD特異性運動癥狀，5周臨床評分已大于10分，表明成功構建PD模型[22]；3個月達到峰值，總分14左右，6個月分數(shù)降至8分左右，之后至6年后基本穩(wěn)定在5分左右。從這些表現(xiàn)可以將該模型分為以下幾個階段：①急性期：MPTP注射至第4周，出現(xiàn)的全身癥狀反映了MPTP代謝物MPP+對外周器官和多巴胺神經(jīng)元的損傷；②進展期：第4周至3個月，從開始出現(xiàn)運動癥狀到達到頂峰值，反映了黑質(zhì)紋狀體多巴胺神經(jīng)元變性死亡和多巴胺遞質(zhì)的下降；③代償恢復期：第3個月至1年，從運動癥狀達到頂峰值后下降達到穩(wěn)定階段(臨床評分)或完全恢復(24 h軀體自發(fā)運動總量)，反映了肢體或軀體逐漸適應了日?；顒?，源于動物體內(nèi)存在自我補償機制[16]；④慢性期：1年到至少6年，軀體自發(fā)運動總量恢復正常，但受損對側肢體隨意活動仍然受到多巴胺神經(jīng)元不可逆損傷的影響。

造模后3～6個月后最為明顯的變化是動物的受損側支配的上肢震顫得到了改善,其部分運動行為得到緩解，軀體自發(fā)運動基本恢復正常，表明動物體內(nèi)的自身補償[16]，受損多巴胺能神經(jīng)末梢得到代償，受損側紋狀體支配的右側上肢僅可偶爾表現(xiàn)出微弱取食的動作，這與模型穩(wěn)定期動物右側上肢運動技能嚴重缺失不同[23-24]。由于左側紋狀體嚴重不可逆受損，食蟹猴依然保持穩(wěn)定的旋轉行為，其支配的右側上肢隨意運動技能受限，以致動物傾向于使用左側上肢進行精細運動，這也可能與偏側性忽略病癥[25]有關。6年后食蟹猴運動徐緩是其臨床癥狀的主要表現(xiàn)，其中致病原因除多巴胺能神經(jīng)元受到影響外，是否有路易小體及α-突觸核蛋白的參與[20]，則需要進一步研究。

造模后1年至6年間食蟹猴軀體自發(fā)運動總量與造模前基線數(shù)據(jù)差異無統(tǒng)計學意義，白天自發(fā)活動量改善最為明顯，夜間自發(fā)活動量也有改善趨勢。運動活動量為臨床表現(xiàn)的一種量化方式，食蟹猴臨床癥狀得到改善，6年后整體的活動量得以恢復并與基線無異。模型穩(wěn)定期食蟹猴夜間運動活動量顯著下降，可能與夜間運動功能減退[26]有關，夜間運動功能減退是夜間帕金森病的表現(xiàn)，可能需要各種神經(jīng)基質(zhì)和途徑為其執(zhí)行[27]，但是缺乏臨床病理的證明。有研究[28]顯示身體機能、平衡控制、運動障礙與身體的活動量存在呈正相關。

與肌肉注射MPTP所致雙側肢體受累模型猴不同，偏側模型6個月至1年之間的代償恢復期是雙側模型沒有的[29-30]，此階段不需要給予動物左旋多巴即可基本恢復正常自發(fā)活動。在此階段動物可通過非受損側肢體取食而維持基本正常日常活動，避免了較高的病死率且降低了飼養(yǎng)和照料成本；同時，偏側模型可用于研究機體的代償恢復機制。

本研究結果證實MPTP偏側猴模型可導致不可逆的紋狀體損害，引發(fā)持久的精細運動受損，可作為PD模型動物的長期動態(tài)和治療評價研究，為神經(jīng)細胞修復、細胞移植等提供重要的參考價值。

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