大鼠肝內(nèi)淋巴細胞的分離與培養(yǎng)

張曼卡，馬慧敏，張 健，李玉鳳，葉小慧，李 鑫,

1.北京大學(xué)地壇醫(yī)院教學(xué)醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合中心，北京 100015；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合中心；3.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院傳染病研究所；4.北京大學(xué)地壇醫(yī)院教學(xué)醫(yī)院傳染病研究所

自身免疫性肝炎是一種病因未明、病理機制十分復(fù)雜的慢性肝臟炎癥性疾病,其主要表現(xiàn)是肝功能異常、免疫球蛋白升高、自身抗體陽性及特異的肝臟組織病理學(xué)異常改變[1-3]。其發(fā)病機制被認(rèn)為是肝臟的促炎和抗炎機制的失衡所致。它是由于環(huán)境觸發(fā)作用于遺傳上的易感人群，導(dǎo)致T細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答直接作用于肝臟細胞的抗原[4]。因此，能夠?qū)Ω蝺?nèi)淋巴細胞亞群進行分析對闡釋這一疾病的復(fù)雜病理機制顯得至關(guān)重要。然而，目前尚未有專門的肝內(nèi)淋巴細胞分離培養(yǎng)方法。因此，本研究旨在通過建立一種較為簡便且具有很高重復(fù)性的提取大鼠肝內(nèi)淋巴細胞的方法，為進一步研究肝臟免疫疾病奠定實驗工作基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料無特殊病原體級大鼠，體質(zhì)量250～350 g, 雌雄不限，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供。大鼠實驗前12 h禁食、不禁水。本研究在北京地壇醫(yī)院動物實驗倫理委員會批準(zhǔn)下進行。1640培養(yǎng)基(Gibco，1868632)、胎牛血清(Biology Industries，1616316)、L型-谷氨酰胺 (Amresco生物公司)、淋巴細胞分離液(Lymphoprep公司，12GES16)、Cell Strainer(BD公司)、一次性留置針(金環(huán)，29S0301)、PERCP標(biāo)記抗大鼠CD3抗體(ebioscience,4289855)，蔡司(ZEISS)倒置熒光顯微鏡、Eppendorf高速冷凍離心機。

1.2方法

1.2.1 大鼠原代肝淋巴細胞的分離與培養(yǎng): 主要包括灌肝、研磨、純化及培養(yǎng)等步驟, (1)灌肝: 取體質(zhì)量為345 g的無特殊病原體級SD大鼠1只, 術(shù)前12 h禁食、不禁水；用質(zhì)量濃度為40 g/L的戊巴比妥那將大鼠麻醉后, 用大頭針將大鼠呈仰臥位置固定于泡沫板；之后，將質(zhì)量濃度為750 g/L的乙醇噴灑于大鼠皮膚以進行體外消毒；5 min后以U形切口剪開皮層，再次消毒之后剪開肌層，切口上至劍突，下至恥骨聯(lián)合，左右至腋后線；將剪開的皮瓣固定；暴露腹腔后，將靜脈留置針置入肝門靜脈中，拔出針芯，將預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液作為灌注液沖出肝臟內(nèi)血液，用眼科剪剪斷下腔靜脈使灌流液流出，整個過程速度適中，時間控制在5 min左右;待肉眼觀察灌流液顏色清亮?xí)r，小心剝離肝臟周邊黏連組織或結(jié)締組織，摘除肝臟，將其放入盛有預(yù)冷磷酸鹽緩沖液的培養(yǎng)皿中。(2)研磨：將剝離的肝臟置入超凈臺中進行下一步操作。先用磷酸鹽緩沖液沖洗肝臟2遍以沖洗表面的血污水，倒掉漂洗液后再用眼科剪將肝臟剪成約10 mm×10 mm的小塊，使用Cell Strainer配合10 ml注射器針芯將肝臟研磨至細胞懸液。(3)純化與培養(yǎng)：收集細胞懸液后以50×g的速度，離心3 min，將上清收入離心管中放冰上待用，再將離心沉淀加入磷酸鹽緩沖液重懸，重復(fù)離心取上清2次；將3次收集的上清1 200×g，5 min離心，將沉淀用8 ml磷酸鹽緩沖液重懸，將8 ml細胞懸液緩慢鋪層于4 ml淋巴細胞分離液上，450×g，升9降1，離心20 min，之后吸取中間白膜層于8 ml預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液中，1 500×g，10 min離心，棄上清；1 200×g，5 min離心，棄上清。計數(shù)后，以1×106密度培養(yǎng)于24孔板中，培養(yǎng)基為1640培養(yǎng)基。然后置入體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每天觀察1次細胞形態(tài)及培養(yǎng)液狀況。

1.2.2 大鼠肝內(nèi)淋巴細胞的形態(tài)學(xué)觀察：采用蔡司倒置顯微鏡, 觀察肝內(nèi)淋巴細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu), 主要包括細胞的大小形態(tài)及細胞表面光滑度等。

1.2.3 流式細胞術(shù)鑒定大鼠肝內(nèi)T淋巴細胞：將提取的細胞吸取轉(zhuǎn)移至流式管中，以1 200×g的轉(zhuǎn)速離心5 min，棄上清； 每管染T細胞特性的標(biāo)記CD3抗體1 μl，渦旋混勻，4 ℃ 避光染色 15 min；加 2 ml PBEB 渦旋，以 1200 r/min，離心5 min洗滌細胞，棄上清；向流式管中加入 200 μl PBS，流式上機收取細胞105個后使用流式數(shù)據(jù)分析軟件Flowjo進行分析。

2 結(jié)果

2.1肝內(nèi)淋巴細胞的形態(tài)學(xué)觀察細胞培養(yǎng)時,觀察到細胞為規(guī)則的圓形，細胞表面較為平滑，胞質(zhì)透明清亮，中間略隆起，直徑為6～7 μm，呈典型的淋巴細胞形態(tài)(見圖1)。

2.2流式細胞儀檢測我們采用流式細胞儀進行T淋巴細胞特異性表位CD3進行染色，上機收取105個細胞，F(xiàn)lowjo軟件分析顯示，T淋巴細胞比例為51.2%(見圖2)。

圖1 淋巴細胞形態(tài)學(xué)觀察(200×) A：細胞培養(yǎng)0 h； B：細胞培養(yǎng)24 h；C：細胞培養(yǎng)48 hFig 1 The morphological observation of lymphocytes (200×) A: cells were cultured for 0 hour; B: cells were

圖2 淋巴細胞流式畫門策略及T淋巴細胞鑒定Fig 2 The gating strategy for intrahepatic T cells and the identification of T lymphocytes

3 討論

肝臟是機體重要的免疫器官，在機體的免疫中占重要的地位。研究[5-7]發(fā)現(xiàn),淋巴細胞及其亞群的變化參與了一些肝臟疾病的發(fā)病過程,如乙型肝炎、丙型肝炎、戊型肝炎、自身免疫性肝病等。因此，能夠?qū)α馨图毎麃喨哼M行精準(zhǔn)的分析就顯得尤為重要。而此項工作的重要基礎(chǔ)是對肝內(nèi)淋巴細胞進行分離與純化。

然而，目前仍未有一種可被廣泛接受的分離提取原代肝內(nèi)淋巴細胞的方法。本實驗首先利用淋巴細胞與肝實質(zhì)細胞密度的不同，先利用離心法去除肝實質(zhì)細胞的影響。而后，由于淋巴細胞的體積、形態(tài)和密度與其他細胞不同，而淋巴細胞分離液是一種密度為1.075～1.090近似于等滲的溶液,故而我們使用它進行密度梯度離心,從而將肝內(nèi)淋巴細胞分離出來，同時利用流式細胞儀的定量分析,客觀、簡單地對肝內(nèi)淋巴細胞亞群進行鑒定檢測[8-11]。

由于淋巴細胞分類較多，表型不同，故現(xiàn)在仍缺乏一種鑒定全部淋巴細胞的可靠方法。本實驗選取其中的T淋巴細胞亞群進行鑒定分析。成功分離純化淋巴細胞后，還可以借助磁珠將感興趣的亞群進一步分選以便進一步實驗分析[12-14]。

原代細胞的培養(yǎng)是指直接從機體取下細胞、組織和器官后立即進行培養(yǎng)。此時的細胞保持原有細胞的基本性質(zhì)，原代肝內(nèi)淋巴細胞可以很好地模擬體內(nèi)肝臟的免疫環(huán)境，可以作為病理機制闡明及藥物實驗的可靠模型。

總之, 本實驗運用大鼠正常的肝臟組織，采用原位灌注及密度梯度離心法相結(jié)合成功分離和培養(yǎng)了大鼠肝內(nèi)淋巴細胞，這種方法操作較簡單, 重復(fù)性比較性好，成功率較高,解決了肝內(nèi)淋巴細胞分離培養(yǎng)的問題，為進一步開展肝臟的免疫學(xué)研究提供了非常好的體外細胞模型。

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