農(nóng)藥吡蟲啉酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法研究進(jìn)展

譚桂玉，陳俊玉，劉偉華，何 佳，李 燕，胡志鑫

(1.福建安欣睿捷生物科技有限公司，福建福州 350003；2.東山出入境檢驗(yàn)檢疫局，福建東山 363401)

吡蟲啉(Imidacloprid)是一種含吡啶環(huán)的超高效內(nèi)吸性殺蟲劑，1991年由德國(guó)Bayer公司在英國(guó)布萊頓作物保護(hù)會(huì)議上首次報(bào)道其功效。此后多年的應(yīng)用表明，吡蟲啉能選擇性抑制昆蟲神經(jīng)系統(tǒng)中的乙酰膽堿受體，破壞昆蟲中樞神經(jīng)的正常轉(zhuǎn)導(dǎo)，造成害蟲出現(xiàn)麻痹進(jìn)而死亡[1]，具有高效、低毒、廣譜、殘效期長(zhǎng)、內(nèi)吸性強(qiáng)的特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于小麥、蔬菜、水稻、棉花等農(nóng)作物。

雖然吡蟲啉具有良好的殺蟲效果，但殘留期較長(zhǎng)。研究表明，吡蟲啉在酸性介質(zhì)中非常穩(wěn)定，幾乎不水解；中性條件下水解速度類似于酸性條件，90 d后樣品僅降解了1.5%；堿性條件下吡蟲啉穩(wěn)定性較酸性、中性條件差，但仍相當(dāng)穩(wěn)定，pH 8時(shí)樣品90 d降解了5.3%，pH 9時(shí)樣品降解了20.0%[2]。

吡蟲啉的穩(wěn)定性勢(shì)必會(huì)引起農(nóng)產(chǎn)品中的殘留，并對(duì)后續(xù)市場(chǎng)行為產(chǎn)生一系列不利影響，因此，吡蟲啉的檢測(cè)十分必要。目前，吡蟲啉的檢測(cè)包括生物分析法[3-4]、氣相-質(zhì)譜聯(lián)用法[5-6]、液相色譜法[7-8]、液相-質(zhì)譜聯(lián)用法[9-10]、酶聯(lián)免疫檢測(cè)法(ELISA)[11-12]、免疫層析檢測(cè)法[13-14]等。其中，酶聯(lián)免疫檢測(cè)法因其快速、高通量、靈敏度高、前處理較簡(jiǎn)便、成本低廉、對(duì)操作人員儀器要求較低等優(yōu)點(diǎn)，被廣大檢測(cè)工作者所接受。目前，國(guó)內(nèi)外都陸續(xù)設(shè)計(jì)研發(fā)了針對(duì)吡蟲啉農(nóng)藥殘留的酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法。筆者就目前應(yīng)用于吡蟲啉的酶聯(lián)免疫檢測(cè)法研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 半抗原設(shè)計(jì)

小分子酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法研究的前提是設(shè)計(jì)合理的半抗原，再利用半抗原與載體蛋白連接制備完全抗原。吡蟲啉分子量為255.7，為一種小分子，其化學(xué)結(jié)構(gòu)是通過碳鏈連接的咪唑環(huán)和吡啶環(huán)，咪唑環(huán)上有一個(gè)—NO2，吡啶環(huán)上有一個(gè)—Cl。這些基團(tuán)與載體蛋白的連接較困難，需要對(duì)吡蟲啉分子先進(jìn)行衍生。在前人的報(bào)道中，有6種衍生方法(圖1)，分別給吡蟲啉分子衍生了易于與載體蛋白連接的—COOH(I[15]、Ⅱ[15]、Ⅲ[16]、Ⅳ[17]、V[16])或是—NH2(VI[18])。其中，半抗原I和 Ⅱ 最早被設(shè)計(jì)并制備抗體，因?yàn)槔冒肟乖?Ⅱ 制備的抗體非常靈敏，在后續(xù)研究中半抗原 Ⅱ 被廣泛應(yīng)用。比較6個(gè)半抗原，半抗原 Ⅱ 從—Cl衍生簡(jiǎn)單碳鏈，對(duì)吡蟲啉的結(jié)構(gòu)改動(dòng)最小。這種衍生將咪唑環(huán)及其上的—NO2展露在外，更易激發(fā)免疫動(dòng)物的應(yīng)激反應(yīng)，產(chǎn)生靈敏度高的抗體。

2 抗體制備及酶免疫檢測(cè)方法的建立

半抗原設(shè)計(jì)制備后，即可進(jìn)行完全抗原的合成，并制備抗體。最初為吡蟲啉制備的是多克隆抗體(pAb)。pAb制備較簡(jiǎn)單，多為免疫動(dòng)物的血清，但其不同批次間差異較大。隨著時(shí)間推移，吡蟲啉單克隆抗體(mAb)的報(bào)道逐漸增多，mAb性質(zhì)單一穩(wěn)定，且具有無限使用的優(yōu)勢(shì)。利用這2種抗體，直接競(jìng)爭(zhēng)免疫測(cè)定(dc-ELISA)和間接競(jìng)爭(zhēng)免疫測(cè)定(ic-ELISA)均有建立。從已有報(bào)道看，pAb和mAb之間、dc-ELISA和ic-ELISA之間在靈敏度方面并無明顯差別。方法靈敏度的高低最終取決于半抗原設(shè)計(jì)及其所篩選到的抗體，半抗原 Ⅱ 所制備的抗體，其靈敏度明顯高于其他半抗原。Kim等[19]利用半抗原 Ⅱ 制備得到mAb，分別建立了dc-ELISA和ic-ELISA，dc-ELISA的IC50為0.3 μg/L，檢測(cè)限(LOD)達(dá)0.03 μg/L，為所有報(bào)道中最靈敏的方法。Wang等[20]、Zhang等[21]也利用半抗原 Ⅱ 制備抗體，但制備的是pAb，僅建立了ic-ELISA，在LOD上與Kim等[19]研究結(jié)果一致，也為0.03 ng/mL，IC50為1.2～3.0 ng/mL。在LOD一致的情況下，Wang 等[20]、Zhang等[21]利用pAb所建立的ELISA，比Kim等[19]建立的方法檢測(cè)范圍更大。Lee等[16]利用半抗原 Ⅲ 和 V 制備抗體建立ic-ELISA，IC50為17.3 ng/mL；Li等[17]利用半抗原 Ⅱ、Ⅲ 和 Ⅳ 制備抗體建立ic-ELISA，IC50為995.4 ng/mL；馬寅生等[18]利用半抗原 Ⅵ 制備抗體建立ic-ELISA，IC50為12.9 μg/kg，在靈敏度上均沒有半抗原 Ⅱ 所建立的方法理想。

圖1 吡蟲啉及其半抗原Fig.1 Imidacloprid and its haptens

3 ELISA在吡蟲啉農(nóng)殘檢測(cè)中的應(yīng)用

ELISA方法建立后，將其應(yīng)用于實(shí)際樣品的檢測(cè)。由于不同樣品的基質(zhì)干擾不同，針對(duì)不同樣品，還需要進(jìn)行提取方法的優(yōu)化。目前已報(bào)道中，針對(duì)環(huán)境污染而進(jìn)行的檢測(cè)集中在水樣和土樣，針對(duì)食品殘留，研發(fā)的是水果和蔬菜的檢測(cè)，包括蘋果、葡萄、黃瓜、青椒和番茄等。相比較于氣相色譜檢測(cè)、液相色譜檢測(cè)的樣品前處理方法，ELISA的樣品前處理方法較為簡(jiǎn)單。在流體樣品(水、果汁、蜂蜜、葡萄藤汁液)的處理中，大都僅需要將樣品進(jìn)行稀釋，即可進(jìn)行吡蟲啉含量的測(cè)定[19, 22-25]。固體樣品的前處理則由于基質(zhì)不同而比較多樣：通常先將樣品研漿，用甲醇或乙腈等有機(jī)溶劑對(duì)樣品中的吡蟲啉進(jìn)行提取，通過離心或過濾去除樣品殘?jiān)?。而后，Wanatabe等[26]、Kim等[19]直接用PBS稀釋提取液進(jìn)行ELISA測(cè)定，Li等[15]、Lee等[16]、Watanabe等[27-28]、Xu等[29-30]、Wang 等[20]、李廣領(lǐng)等[31]、劉劍鋒等[32]則將上清液通過液氮吹干、真空抽干的方式進(jìn)行濃縮，最后以適量的水性溶液(PBS、水：甲醇)復(fù)溶進(jìn)行ELISA測(cè)定。

國(guó)內(nèi)外吡蟲啉酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法見表1。

表1 國(guó)內(nèi)外吡蟲啉酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法

4 吡蟲啉商業(yè)ELISA試劑盒

目前，市場(chǎng)上已經(jīng)出現(xiàn)針對(duì)吡蟲啉農(nóng)殘檢測(cè)的ELISA試劑盒，Watanabe等[23, 27]，采用的是Horiba Biotechnology Co., Ltd. Japan公司生產(chǎn)的SmartAssay series吡蟲啉檢測(cè)試劑盒。Byrne等[22]采用EnviroLogix Inc., Portland公司生產(chǎn)的ELISA試劑盒。馬寅生等[18]采用的是北京勤邦生物技術(shù)有限公司的試劑盒。這些試劑盒均采用dc-ELISA的形式，操作步驟少，因而操作人員的失誤率減少，更易得到準(zhǔn)確結(jié)果。此外，這些試劑盒對(duì)其應(yīng)用的樣品及其處理方法具有嚴(yán)格規(guī)定，如不在其規(guī)定范圍內(nèi)，則還需要根據(jù)樣品先進(jìn)行前處理方法的研發(fā)。

5 展望

2012年，24 t進(jìn)口秘魯冷凍草莓在山東蓬萊口岸進(jìn)境檢驗(yàn)時(shí)被發(fā)現(xiàn)吡蟲啉殘留嚴(yán)重超標(biāo)，口岸部門依法對(duì)貨物實(shí)施退運(yùn)處理。2014年，一批進(jìn)口烏龍茶在青島出入境檢驗(yàn)檢疫局抽樣檢驗(yàn)時(shí)被檢出吡蟲啉超標(biāo)。近年來我國(guó)進(jìn)出口農(nóng)產(chǎn)品中吡蟲啉殘留超標(biāo)事件，都說明吡蟲啉農(nóng)殘問題的嚴(yán)重性與迫切性。隨之，其農(nóng)殘檢測(cè)方法也越來越受到重視。

酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法是以抗原和抗體的特異性結(jié)合為基礎(chǔ)，利用光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)建立起來的分析技術(shù)。其在樣品前處理的簡(jiǎn)便性方面具有儀器檢測(cè)所不具備的巨大優(yōu)勢(shì)，且其檢測(cè)時(shí)間短，檢測(cè)成本低，對(duì)操作人員要求較低，特別適用于大批量樣品的檢測(cè)，必將成為吡蟲啉殘留檢測(cè)的一種趨勢(shì)。

[1] CLAUDE A T,RAINBOW P,MICHLE R.Tolerance to environmental contaminants[M].Boca Raton, FL:CRC Press,2011.

[2] 鄭巍,宣日成,劉維屏.新農(nóng)藥吡蟲啉水解動(dòng)力學(xué)和機(jī)理研究[J].環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào),1999, 19(1):101-104.

[4] RUST M K,VETTER R,DENHOLM I,et al.Susceptibility of cat fleas (Siphonaptera:Pulicidae) to fipronil and imidacloprid using adult and larval bioassays[J].J Med Entomol,2014,51(3):638-643.

[6] MACDONALD L M,MEYER T R.Determination of imidacloprid and triadimefon in white pine by gas chromatography/mass spectrometry [J].J Agric Food Chem,1998,46(8):3133-3138.

[7] BASKARAN S,KOOKANA R S,NAIDU R.Determination of the insecticide imidacloprid in water and soil using high-performance liquid chromatography[J].J Chromatogr A,1997,787(1/2):271-275.

[8] FERNANDEZ-ALBA A R,VALVERDE A,AGüERA A,et al.Determination of imidacloprid in vegetables by high-performance liquid chromatography with diode-array detection[J].J Chromatogr A,1996, 721(1):97-105.

[9] TIMOFEEVA I,SHISHOV A,KANASHINA D,et al.On-line in-syringe sugaring-out liquid-liquid extraction coupled with HPLC-MS/MS for the determination of pesticides in fruit and berry juices[J].Talanta,2017,167:761-767.

[10] BONMATIN J M,MOINEAU I,CHARVET R,et al.A LC/APCI-MS/MS method for analysis of imidacloprid in soils, in plants, and in pollens [J].Anal Chem,2003,75(9):2027-2033.

[11] GIROTTI S,MAIOLINI E,GHINI S,et al.Quantification of imidacloprid in honeybees:Development of a chemiluminescent ELISA[J].Anal Lett, 2010,43(3):466-475.

[12] EISENBACK B M,MULLINS D E,SALOM S M,et al.Evaluation of ELISA for imidacloprid detection in eastern hemLock(Tsugacanadensis)wood and needle tissues[J].Pest Manag Sci,2009, 65(2):122-128.

[13] 袁寶鳳,亢歡虎,王麗,等.甲霜靈、吡蟲啉膠體金免疫層析試紙與色譜儀檢測(cè)蔬菜農(nóng)藥殘留比對(duì)試驗(yàn)分析[J].陜西農(nóng)業(yè)科學(xué),2013,59(5):69-72.

[14] 萬積成,林源,王金花,等.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜與膠體金法檢測(cè)蔬菜中吡蟲啉殘留比較[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志, 2009(10):2258-2259.

[15] LI K,LI Q X.Development of an enzyme-linked immunosorbent assay for the insecticide imidacloprid [J].J Agric Food Chem,2000,48(8):3378-3382.

[16] LEE J K,AHN K C,PARK O S,et al.Development of an ELISA for the detection of the residues of the insecticide imidacloprid in agricultural and environmental samples[J].J Agric Food Chem, 2001,49(5):2159-2167.

[17] LI Z X,LIU Y L,SUN Y M,et al.Development of polyclonal antibody based enzyme-linked immunosorbent assay for the analysis of the agricultural insecticide imidacloprid:Food quality and safety[J].Asia Pac J Clin Nutr,2007,16(S1):102-105.

[18] 馬寅生,馮才偉,賈芳芳,等.一種吡蟲啉的酶聯(lián)免疫快速檢測(cè)試劑盒的研制[J].山東畜牧獸醫(yī),2013,34(5):6-8.

[19] KIM H J,SHELVER W L,LI Q X.Monoclonal antibody-based enzyme-linked immunosorbent assay for the insecticide imidacloprid [J].Anal Chim Acta,2004,509(1):111-118.

[20] WANG R M,WANG Z H,YANG H,et al.Highly sensitve and specific detection of neonicotinoid insecticide imidacloprid in environmental and food samples by a polyclonal antibody-based enzyme-linked immunosorbent assay[J].J Sci Food Agric,2012,92(6):1253-1260.

[21] ZHANG L N,WANG Z F,WEN Y B,et al.Simultaneous detection of parathion and imidacloprid using broad-specificity polyclonal antibody in enzyme-linked immunosorbent assay[J].Anal Methods, 2014,7(1):205-210.

[22] BYRNE F J,CASTLE S J,BI J L,et al.Application of competitve enzyme-linked immunosorbent assay for the quantification of imidacloprid titers in xylem fluid extracted from grapevines[J].J Econ Entomol,2005, 98(1):182-187.

[23] WATANABE E,BABA K,EUN H,et al.Application of a commercial immunoassay to the direct determination of insecticide imidacloprid in fruit juices[J].Food chemistry,2007,102(3):745-750.

[24] MA H X,XU Y J,LI Q X,et al.Application of enzyme-linked immunosorbent assay for quantification of the insecticides imidacloprid and thiamethoxam in honey samples[J].Food Addit Contam:Part A,2009,26(5):713-718.

[25] 彭方毅,姜海蓉,陳遠(yuǎn)翔,等.吡蟲啉的酶聯(lián)免疫吸附分析方法研究[J].分析化學(xué),2010, 38(12):1737-1741.

[26] WANATABE S,ITO S,KAMATA Y,et al.Development of competitve enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) based on monoclonal antibodies for chloronicotinoid insecticides imidacloprid and acetamiprid [J].Analytica chimica acta,2001,427(2):211-219.

[27] WATANABE E,EUN H,BABA K,et al.Evaluation and validation of a commercially available enzyme-linked immunosorbent assay for the neonicotinoid insecticide imidacloprid in agricultural samples[J].J Agric Food Chem,2004,52(10):2756-2762.

[28] WATANABE E,EUN H,BABA K,et al.Rapid and simple screening analysis for residual imidacloprid in agricultural products with commercially available ELISA[J].Analytica chimica acta,2004,521(1):45-51.

[29] XU T,JACOBSEN C M,CHO I K,et al.Application of an enzyme-linked immunosorbent assay for the analysis of imidacloprid in wiliwili tree,ErythrinasandwicensisO.Deg, for control of the waspQuadrastichuserythrinae[J].J Agric Food Chem,2006,54(22):8444-8449.

[30] XU T,WEI K Y,WANG J,et al.Quantitatve analysis of the neonicotinoid insecticides imidacloprid and thiamethoxam in fruit juices by enzyme-linked immunosorbent assays[J].J AOAC Int,2010,93(1):12-18.

[31] 李廣領(lǐng),姜金慶,陳錫嶺,等.吡蟲啉殘留酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)方法的建立[J].食品科學(xué),2011, 32(12):228-233.

[32] 劉劍鋒,劉志平,王楷,等.稻谷中吡蟲啉殘留的免疫分析技術(shù)研究[J].糧食科技與經(jīng)濟(jì),2015, 40(2):36-40.