鼠尾藻巖藻黃素超聲輔助提取及其純化工藝優(yōu)化

王 樂(lè),李 麗,牟海津

(中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東青島 266003)

巖藻黃素(fucoxanthin)亦稱巖藻黃質(zhì)、褐藻素,是一種脂溶性天然類胡蘿卜素,為褐藻、硅藻、金藻及黃綠藻所含的色素,在褐藻中的量很高,其結(jié)構(gòu)如圖1所示。其外觀為黃色粉末,不溶于水,易溶于乙醇。在偏酸性溶液、弱光和低溫下比較穩(wěn)定;在弱酸、弱堿條件下,發(fā)生顏色可逆變化;在強(qiáng)堿、強(qiáng)光或高溫條件下則被破壞[1]。已經(jīng)有研究證明巖藻黃素具有一定的抗癌、抗炎、抗氧化、抗肥胖等生物活性[2-6]。

圖1 巖藻黃素結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of fucoxanthin

鼠尾藻(Sargassumthunbergii(Mert.)O’Kuntze)屬于馬尾藻科馬尾藻屬,是太平洋西部特有的暖溫帶性海藻,是我國(guó)沿海常見(jiàn)的一種經(jīng)濟(jì)褐藻,主要分布于浙江東海近海區(qū)域、遼寧至福建沿海北起遼東半島,南至雷州半島的硇州島,均有分布[7]。目前,鼠尾藻主要作為海參的飼料,應(yīng)用于海參的養(yǎng)殖。國(guó)內(nèi)大多關(guān)注于海帶(Lam-inariajaponica)、裙帶菜(Undariapinnatifida)、羊棲菜(Sargassumfusiforme)中巖藻黃素的提取工藝,對(duì)鼠尾藻中巖藻黃素的提取純化工藝的報(bào)道很少,且傳統(tǒng)方法提取時(shí)間長(zhǎng)、溶劑消耗多、提取成本高[8-10],這嚴(yán)重制約了鼠尾藻巖藻黃素的大力開(kāi)發(fā)以及工業(yè)化生產(chǎn)。

本文以鼠尾藻為原料,首先利用超聲波輔助提取法和響應(yīng)曲面法對(duì)巖藻黃素的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,然后運(yùn)用硅膠層析柱對(duì)巖藻黃素粗品進(jìn)行純化,最后借助高效液相色譜法和質(zhì)譜分析法對(duì)巖藻黃素進(jìn)行分析。這不僅為鼠尾藻的大力開(kāi)發(fā)利用提供了新的方向,同時(shí)也為制備高純度巖藻黃素的工業(yè)化生產(chǎn)提供了技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鼠尾藻 浙江舟山;200～300 目層析柱硅膠 青島邦凱高新技術(shù)材料有限公司;醋酸銨 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;無(wú)水乙醇 天津市富宇精細(xì)化工有限公司;L-抗壞血酸 天津市瑞金特化學(xué)品有限公司;乙腈 美國(guó)Merck公司;甲醇 美國(guó)Merck公司;巖藻黃素標(biāo)品 純度≥99%,Sigma-Aldrich試劑公司。

Agilent 1260 Infinity高效液相色譜儀、Agilent 1260 Infinity/6410B液質(zhì)聯(lián)用儀 Agilent公司;Millipore Q超純水器 美國(guó)Millipore公司;KQ5200E超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;JA1003分析天平 上海天平儀器廠;TQ-2000Y粉碎機(jī) 永康市天祺盛世工貿(mào)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 鼠尾藻干粉的制備 新鮮的鼠尾藻用自來(lái)水清洗,紗絹過(guò)濾去除多余水分,置于50 ℃鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)干燥至恒重。干燥后的鼠尾藻用粉碎機(jī)粉碎,過(guò)60目篩,制得鼠尾藻干粉。

1.2.2 鼠尾藻巖藻黃素的提取 參照閆相勇等[10]的方法并做適當(dāng)調(diào)整：精確稱取一定量的鼠尾藻干粉和L-抗壞血酸，按照一定的液料比與一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液均勻混合，在一定的超聲溫度下提取一定時(shí)間，提取液于4800 r/min離心20 min后取上清液測(cè)定吸光值，計(jì)算巖藻黃素得率。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)巖藻黃素得率的影響 稱取10 g鼠尾藻粉,加入1.0%的L-抗壞血酸,按液料比為10 mL/g,分別加入50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液,置于溫度為50 ℃的超聲波清洗器中,超聲30 min,提取2次,取上清液,測(cè)定吸光值,計(jì)算巖藻黃素得率。

1.2.3.2 超聲時(shí)間對(duì)巖藻黃素得率的影響 稱取10 g鼠尾藻粉,加入1.0%的L-抗壞血酸,按液料比為10 mL/g,加入80%的乙醇溶液,置于溫度為50 ℃的超聲波清洗器中,分別超聲10、20、30、40、50、60 min,提取2次,取上清液,測(cè)定吸光值,計(jì)算巖藻黃素得率。

1.2.3.3 超聲溫度對(duì)巖藻黃素得率的影響 稱取10 g鼠尾藻粉,加入1.0%的L-抗壞血酸,按液料比為10 mL/g,加入80%的乙醇溶液,置于超聲波清洗器中,設(shè)置溫度分別為30、40、50、60、70 ℃,超聲30 min,提取2次,取上清液,測(cè)定吸光值,計(jì)算巖藻黃素得率。

1.2.3.4 液料比對(duì)巖藻黃素得率的影響 稱取10 g鼠尾藻粉,加入1.0%的L-抗壞血酸,分別按液料比為4、7、10、13、15 mL/g,加入80%的乙醇溶液,置于溫度為50 ℃的超聲波清洗器中,超聲30 min,取上清液,提取2次,測(cè)定吸光值,計(jì)算巖藻黃素得率。

1.2.3.5 L-抗壞血酸添加量對(duì)巖藻黃素得率的影響 稱取10 g鼠尾藻粉,分別加入0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%的L-抗壞血酸,按液料比為10 mL/g,加入80%的乙醇溶液,置于溫度為50 ℃的超聲波清洗器中,超聲30 min,提取2次,取上清液,測(cè)定吸光值,計(jì)算巖藻黃素得率。

1.2.3.6 提取次數(shù)對(duì)巖藻黃素得率的影響 稱取10 g鼠尾藻粉,加入1.0%的L-抗壞血酸,按液料比為10 mL/g,加入80%的乙醇溶液,置于溫度為50 ℃的超聲波清洗器中,超聲30 min,分別提取1次、2次、3次,取上清液,測(cè)定吸光值,計(jì)算巖藻黃素得率。

1.2.4 巖藻黃素響應(yīng)曲面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)響應(yīng)面分析軟件Design Expert 8.0所提供的 Box-Behnken 模型[12-13],以超聲溫度(A)、超聲時(shí)間(B)和乙醇體積分?jǐn)?shù)(C)三因素為自變量,巖藻黃素得率為響應(yīng)值,設(shè)計(jì)出三因素三水平的實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)因素與水平的取值見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面因素水平編碼表Table 1 Factors and levers of response surface test

1.2.5 鼠尾藻巖藻黃素的純化 將粗提液于45 ℃減壓濃縮至原體積的1/5,濃縮液用三倍體積的石油醚在室溫下萃取30～60 min,萃取3次,合并提取液,45 ℃減壓濃縮至原體積的1/5,濃縮液用硅膠柱(16 mm×400 mm)進(jìn)行純化,以石油醚∶乙酸乙酯(7∶1、5∶1、3∶1、3∶2、1∶1、2∶3)混合溶劑為洗脫液,分別洗脫三個(gè)柱體積,洗脫速度為1 mL/min,收集分離物中金黃色液體,即鼠尾藻巖藻黃素純化物。放入棕色瓶中,4 ℃冰箱避光保存。

1.2.6 高效液相色譜法測(cè)巖藻黃素含量 取巖藻黃素醇提液和硅膠柱分離純化液進(jìn)行HPLC色譜鑒定。色譜條件[11]:Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(5 μm×4.6 mm×250 mm),檢測(cè)波長(zhǎng):450 nm,柱溫:30 ℃,流動(dòng)相:乙腈∶甲醇∶0.1%醋酸銨(V/V/V,75∶15∶10),流速:1 mL/min。

精確稱取1 mg巖藻黃素標(biāo)品,用甲醇定容至5.0 mL,配制成濃度分別為200 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液。分別取0.01、0.02、0.05、0.08、0.1、0.15 mL標(biāo)準(zhǔn)液,用甲醇定容至0.4 mL,配制成濃度分別為5、10、25、40、50、75 μg/mL的巖藻黃素溶液,采用HPLC法測(cè)定巖藻黃素含量并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,各濃度梯度重復(fù)測(cè)定三次,取平均值。以巖藻黃素峰面積(Y)對(duì)其濃度(X)進(jìn)行線性回歸,得巖藻黃素線性回歸方程為Y=108.79 X+41.616(R2=0.9994),根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算巖藻黃素含量。

1.2.7 巖藻黃素質(zhì)譜(ESI/MS)分析 將硅膠層析柱純化后的巖藻黃素溶液上樣質(zhì)譜分析。采用電噴霧(ESI)質(zhì)譜直接進(jìn)樣法,正離子檢測(cè)模式,電子轟擊能量70 eV,掃描范圍為100～1000 m/z,柱流速1.0 μL/min,通過(guò)進(jìn)樣閥將樣品溶液送入儀器中進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)巖藻黃素得率的影響 由圖2可知,當(dāng)乙醇濃度在50%至90%之間時(shí),巖藻黃素得率隨著乙醇濃度的增大呈現(xiàn)出先增大后減小的過(guò)程,當(dāng)乙醇濃度達(dá)到80%時(shí),巖藻黃素得率達(dá)到了最大值。這可能是因?yàn)楫?dāng)乙醇濃度為80%時(shí),巖藻黃素的極性與溶劑的極性相近,所以巖藻黃素得率較高。因此選擇 80%的乙醇作為實(shí)驗(yàn)較佳的乙醇體積分?jǐn)?shù)。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)巖藻黃素得率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on extraction yield of fucoxanthin

2.1.2 超聲時(shí)間對(duì)巖藻黃素得率的影響 由圖3可知,超聲時(shí)間在10～30 min內(nèi),巖藻黃素得率隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增大,當(dāng)提取時(shí)間超過(guò)30 min 時(shí)得率開(kāi)始逐漸下降。這可能是由于在短時(shí)間內(nèi),超聲作用促進(jìn)了細(xì)胞的破裂,巖藻黃素分子不斷擴(kuò)散與提取溶劑發(fā)生作用,提取效果顯著提高,但是超過(guò)一定的時(shí)間后,一些如熱效應(yīng)、化學(xué)效應(yīng)對(duì)巖藻黃素的破壞,導(dǎo)致巖藻黃素的得率下降[11]。因此選擇30 min作為實(shí)驗(yàn)較佳提取時(shí)間。

圖3 超聲時(shí)間對(duì)巖藻黃素得率的影響Fig.3 Effect of ultrasound treatment time on extraction yield of fucoxanthin

2.1.3 超聲起始溫度對(duì)巖藻黃素得率的影響 由圖4可知,巖藻黃素得率隨著超聲起始溫度的升高先增大后減小,在達(dá)到50 ℃時(shí),巖藻黃素得率達(dá)到最大值;在50～70 ℃時(shí),巖藻黃素得率有所下降,這可能是剛開(kāi)始隨著溫度的升高溶劑體系內(nèi)的分子運(yùn)動(dòng)加劇,提高了巖藻黃素得率,但溫度超過(guò)50 ℃時(shí),由于受到超聲波的機(jī)械效應(yīng)和熱效應(yīng),使巖藻黃素的穩(wěn)定性發(fā)生改變,導(dǎo)致巖藻黃素得率下降[14]。因此選擇50 ℃作為實(shí)驗(yàn)較佳溫度。

圖4 超聲起始溫度對(duì)巖藻黃素得率的影響Fig.4 Effect of ultrasound temperature on extraction yield of fucoxanthin

2.1.4 液料比對(duì)巖藻黃素得率的影響 由圖5可知,在液料比為10 mL/g之前,巖藻黃素得率隨溶劑用量的增大而增大,并在10 mL/g時(shí)達(dá)到最大值,之后繼續(xù)增加溶劑用量,得率上升趨勢(shì)緩慢。這主要是由于料液比的增大使得巖藻黃素與有機(jī)溶劑的接觸更加的充分,從而使得巖藻黃素得率升高,但是這種擴(kuò)散所帶來(lái)的升高是有限度的?？紤]到提取成本,選擇液料比為10 mL/g作為實(shí)驗(yàn)的較佳液料比。

圖5 液料比對(duì)巖藻黃素得率的影響Fig.5 Effect of liquid/material ratio on extraction yield of fucoxanthin

2.1.5 L-抗壞血酸添加量對(duì)巖藻黃素得率的影響 由圖6可知,提取的過(guò)程中加入L-抗壞血酸可以有效提高巖藻黃素得率,這主要是由于抗壞血酸的抗氧化作用可以有效保護(hù)巖藻黃素在提取過(guò)程中不被氧化,使得巖藻黃素得率得到明顯地提高。綜合考慮后,選擇L-抗壞血酸的添加量為0.8%作為實(shí)驗(yàn)的較佳提取條件。

圖6 L-抗壞血酸添加量對(duì)巖藻黃素得率的影響Fig.6 Effect of L-ascorbic acid concentration on extraction yield of fucoxanthin

2.1.6 提取次數(shù)對(duì)巖藻黃素得率的影響 由圖7可知,經(jīng)過(guò)兩次提取后,已經(jīng)提取出絕大部分的巖藻黃素,綜合考慮成本,以及長(zhǎng)時(shí)間提取對(duì)巖藻黃素穩(wěn)定性的破壞等因素,最終選取提取2次為較佳提取次數(shù)。

圖7 提取次數(shù)對(duì)巖藻黃素得率的影響Fig.7 Effect of extraction times on extraction yield of fucoxanthin

2.2 響應(yīng)曲面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

2.2.1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,固定液料比為10 mL/g、L-抗壞血酸0.8%,提取2次,以鼠尾藻中巖藻黃素得率為響應(yīng)值,選擇超聲時(shí)間、超聲起始溫度和乙醇體積分?jǐn)?shù)3個(gè)因素,做三因素三水平響應(yīng)面設(shè)計(jì),實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Response surface experimental design and results

2.2.2 模型的建立與顯著性檢驗(yàn) 應(yīng)用Design Expert進(jìn)行回歸擬合分析,可得鼠尾藻中巖藻黃素得率的回歸模型為:

巖藻黃素得率(mg/g)=0.46+0.011A+8.000×10-3B+8.750×10-4C-1.750×10-3AB-8.000×10-3AC-5.750×10-3BC-0.028A2-0.025B2-0.040C2。

表3 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)表Table 3 Test of significance for regression equation coefficients

響應(yīng)面法可以優(yōu)化因素間的相互作用,并得到相應(yīng)的響應(yīng)曲面圖進(jìn)而對(duì)各因素進(jìn)行分析,當(dāng)圖中等高線呈圓形時(shí)表示兩因素交互作用不顯著,而呈橢圓形或馬鞍形時(shí)則表示兩因素交互作用顯著[15]。

圖8A表示超聲時(shí)間一定時(shí),超聲時(shí)間與乙醇體積分?jǐn)?shù)的交互作用。由圖可知,當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)一定時(shí),隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng),巖藻黃素的得率呈現(xiàn)先增大后下降的趨勢(shì);當(dāng)超聲時(shí)間一定時(shí),隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大,巖藻黃素得率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)。由響應(yīng)曲面圖可知其曲面較陡,兩者交互作用較顯著。

圖8B表示超聲時(shí)間一定時(shí),乙醇體積分?jǐn)?shù)和超聲溫度的交互作用?？芍?當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)一定時(shí),隨著超聲起始溫度的升高,巖藻黃素得率呈先增大后減小的趨勢(shì)。當(dāng)超聲溫度一定時(shí),乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)巖藻黃素得率的影響趨勢(shì)相同。由其響應(yīng)曲面圖中的曲面情況可知乙醇體積分?jǐn)?shù)和超聲溫度對(duì)巖藻黃素得率的交互效應(yīng)影響顯著。

圖8 不同交互作用對(duì)巖藻黃素提取率的影響Fig.8 Effects of different interactions on extraction yield of fucoxanthin

圖8C表示乙醇體積分?jǐn)?shù)一定時(shí),超聲時(shí)間和超聲溫度之間的交互作用。當(dāng)超聲溫度一定時(shí),隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng),巖藻黃素的得率增大,超聲時(shí)間超過(guò)30 min后,其得率有所下降;當(dāng)超聲時(shí)間一定時(shí),隨著超聲溫度的提高,巖藻黃素得率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)。響應(yīng)曲面圖中相應(yīng)表現(xiàn)為曲線較為平滑,表明超聲時(shí)間和超聲溫度對(duì)巖藻黃素得率的交互效應(yīng)影響不顯著。

2.2.3 最佳條件的確定和回歸模型的驗(yàn)證 通過(guò)響應(yīng)面法得到超聲波輔助提取鼠尾藻巖藻黃素最佳工藝條件為超聲溫度51.96 ℃,超聲時(shí)間為31.52 min,乙醇體積分?jǐn)?shù)79.80%,此時(shí)巖藻黃素最大理論得率為0.462 mg/g。實(shí)際操作中確定的最佳工藝條件為超聲時(shí)間32 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、超聲起始溫度52 ℃,在此條件下進(jìn)行5次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),得到的多酚平均得率為(0.455±0.046) mg/g,與理論值0.462 mg/g非常接近,證實(shí)了該模型的有效性。

2.3 巖藻黃素高效液相色譜法分析

分別選取巖藻黃素粗提液和經(jīng)過(guò)硅膠柱純化后的巖藻黃素純化物進(jìn)行HPLC分析,結(jié)果如圖9所示,可以看出粗提液色譜圖中,出現(xiàn)了很多吸收峰,且峰型非常復(fù)雜,在7.497 min 出現(xiàn)的吸收峰與標(biāo)準(zhǔn)品吸收峰(7.950 min)對(duì)比,較為接近。而經(jīng)過(guò)硅膠柱純化后巖藻黃素樣品液相圖譜,如圖9(B),與巖藻黃素標(biāo)品出峰保留時(shí)間基本一致,因此可判定該物質(zhì)為巖藻黃素,由此推之,粗提液中峰值保留時(shí)間為7.497 min的物質(zhì)亦為巖藻黃素。按照1.2.4所述方法,通過(guò)公式計(jì)算得純化后巖藻黃素得率為(0.048±0.002) mg/g,純度為86.88%±1.34%(峰面積所占百分比),而純化前的粗提液中巖藻黃素純度僅為23.16%±2.19%(峰面積所占百分比),可知樣品中巖藻黃素純度得到顯著提高,說(shuō)明硅膠柱層析法適用于純化巖藻黃素,適合于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。

圖9 巖藻黃素純化前(A),純化后(B)以及標(biāo)準(zhǔn)品(C)的HPLC圖譜Fig.9 HPLC analyses of fucoxanthin before purification(A), after purification(B)and standard(C)

2.4 巖藻黃素質(zhì)譜分析

圖10所示為純化后的巖藻黃素在ESI正離子模式下的質(zhì)譜圖。圖中出現(xiàn)較強(qiáng)的離子峰697.4[M+K]+、681.4[M+Na]+和準(zhǔn)分子離子峰659.4[M+H]+,同時(shí)還出現(xiàn)了相對(duì)較弱的m/z 581.4[M+H-78]+、360.3、334.3、312.4、177.1、131.1。這些均符合巖藻黃素的特征碎片離子峰,與Britton G[16]報(bào)道一致。

圖10 純化后巖藻黃素質(zhì)譜圖Fig.10 MS chromatogram of fucoxanthin after purification

3 結(jié)論

本研究首先利用超聲波輔助提取鼠尾藻中的巖藻黃素,在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,通過(guò)響應(yīng)曲面法優(yōu)化了鼠尾藻巖藻黃素的提取工藝,建立巖藻黃素的二次多項(xiàng)回歸模型,且擬合情況良好。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,最佳工藝條件為:乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%(V/V),液料比為10 mL/g,L-抗壞血酸的添加量為0.8%,超聲起始溫度為52 ℃,超聲時(shí)間為32 min,在此條件下提取2次,巖藻黃素粗品得率為(0.455±0.046) mg/g。其次,本研究利用硅膠層析柱對(duì)提取的巖藻黃素粗品進(jìn)行了純化,經(jīng)HPLC和MS鑒定,純化后巖藻黃素得率為(0.048±0.002) mg/g,純度高達(dá)86.88%±1.34%。而目前市場(chǎng)上高純度的巖藻黃素需求大、前景廣闊,此工藝提取時(shí)間短、效率高、有機(jī)試劑消耗少,適合于巖藻黃素大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn),為制備高純度的巖藻黃素提供了新的參考依據(jù)。

[1]汪曙暉,薛長(zhǎng)湖. 巖藻黃素的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和功能[J]. 食品工業(yè)科技,2010,31(6):408-410.

[2]徐戎,張悅,王倩,等. 昆布有效成分巖藻黃質(zhì)對(duì)人體7種腫瘤細(xì)胞增殖與凋亡的影響[J]. 中藥藥理與臨床,2009,25(4):21-24.

[3]Kenji S,Kazuhiro O,Iliyana I,et al. Effects of fucoxanthin on lipopolysaccharide-induced inflammationinvitroandinvivo[J]. Experimental Eye Research,2005,81:422-428.

[4]Hayato M,Masashi H,Tokutake S,et al. Fucoxanthin from edible seaweed,Undaria pinnatifida,shows antiobesity effect through UCP1 expression in white adipose tissues[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications,2005,332:392-397.

[5]Matsumoto M,Hosokawa M,Matsukawa N,et al. Suppressive effects of the marine carotenoids,fucoxanthin and fucoxanthinol on triglyceride absorption in lymph duct-cannulated rats[J]. European Journal of Nutrition,2010,49:243-249.

[6]Yan X J,Chuda Y,Suzuki M,et al. Fucoxanthin as the major antioxidant in Hijikia fusiformis,a common edible seaweed[J]. Bioscience,Biotechnology and Biochemistry,1999,63(3):605-607.

[7]江茜,劉東,楊加波,等. 鼠尾藻的化學(xué)成分研究[J]. 中國(guó)藥學(xué)雜志,2012,47(12):948-952.

[8]趙鵬. 海帶中巖藻黃素的提取與純化工藝研究[D]. 北京:北京化工大學(xué),2010.

[9]秦云,孟麗媛,王鳳舞. 復(fù)合酶法提取海帶巖藻黃素及其抗氧化活性分析[J]. 食品科學(xué),2013,34(16):279-283.

[10]閆相勇,劉翼翔,吳永沛,等. 海帶巖藻黃素的提取及純化工藝研究[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào),2014,14(3):115-121.

[11]惠伯棣. 類胡蘿卜素化學(xué)及生物化學(xué)[M]. 北京﹕中國(guó)輕工業(yè)出版社,2005﹕68-322.

[12]尹尚軍,徐濤,劉麗平,等. 羊棲菜巖藻黃質(zhì)的提取工藝研究[J]. 食品工業(yè)科技,2011,32(4)﹕272-275.

[13]費(fèi)榮昌. 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)處理第四版[M]. 上海:華東師范大學(xué)出版社,2001:59-63.

[14]王銀羽. 鼠尾藻中巖藻黃質(zhì)的提取工藝優(yōu)化及降血脂作用的研究[D]. 杭州:浙江工業(yè)大學(xué),2015.

[15]Box G E P,Hunter W G. Statistics for experiments:an introduction to design,data analysis and model building[M]. New York:Wiley,1990.

[16]Britton G,Liaaen-Jensen S,Pfander H,et al. Carotenoids[M]. Basel:Birkllauser Verlag,1995.