轉基因大豆及其制品二重熒光定量PCR的建立與驗證

王鳳軍,葉素丹，*,陳冠武，包永華

(1.浙江經貿職業(yè)技術學院,浙江杭州 310018；2.汕頭出入境檢驗檢疫局，廣東汕頭 515000)

《2016年全球生物技術/轉基因作物商業(yè)化發(fā)展態(tài)勢》報告顯示轉基因大豆的種植面積最大,為9140萬公頃,占全球轉基因作物總種植面積的一半。轉入大豆中的基因種類較多,大致可分為:改善品質、抗蟲、抗旱、除草、抗病、高產等幾個方向[1]。截止2011年,全球共有19個轉基因大豆獲得批準商業(yè)化種植,包括1個抗蟲、3個高油、11個耐除草劑、1個抗蟲耐除草劑、3個耐除草劑高油轉基因大豆。我國是大豆和大豆制品進口國,國內需求不斷增加。目前為止,被批準進入中國的轉基因大豆品系只有10種(A2704-12、A5547-127、CV127、DP305423、DP305423×GTS40-3-2、DP356043、GTS40-3-2、MON87701、MON87701×MON89788、MON89788)[1]。

轉基因生物可以獲得高產和優(yōu)質的產品，這可解決人類糧食短缺,饑餓,貧窮等生存問題,但同時關于轉基因作物的安全擔憂也層出不窮[2-5],轉基因產品的安全性和合理性爭議一直伴隨著轉基因技術的發(fā)展歷程,因此對作物轉基因成分進行檢測也顯得尤為重要。目前轉基因作物檢測主要以PCR方法為主,根據轉基因作物轉化時慣用的啟動子如花椰菜花葉病毒啟動子(P-35S)、胭脂堿合成酶終止子(T-NOS)以及外源啟動子或終止子與作物基因組的交聯(lián)結構基因等設計合成特異性引物,用體外擴增的方法定性檢測轉基因作物樣品[6]。該方法操作簡便,耗時短,可以建立針對某種作物的標準化檢測體系,主要有常規(guī)定性PCR法、巢式PCR法,等溫擴增法和實時熒光定量PCR法等[7-10]。如朱琳峰等[11]使用LAMP檢測方法對抗草甘膦轉基因大豆Cp4-epsps基因進行檢測;付海濱和錢云開等[12-13]使用實時熒光PCR對轉基因大豆的品系進行鑒定。這些傳統(tǒng)的轉基因檢測方法常常局限于單一基因,檢測范圍窄,效率低,迫切需要開發(fā)高通量快捷性的多重熒光PCR檢測方法[14-15]。

本研究通過多重引物和熒光探針組合篩選,反應體系優(yōu)化,特異性、重復性和靈敏性測試以及樣品適用性驗證檢測等過程開發(fā)建立了二重熒光定量PCR檢測技術,該技術可實現(xiàn)一個反應管中同時檢測兩個靶標基因,降低試劑成本,縮短檢測時間,提高檢測效率，為大豆及其深加工產品轉基因成分的快速檢測提供了有效方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

10% Roundup Ready轉基因大豆標準品 深圳安萊爾科技公司;CNAS T025-24/30、CNAS T0659-23/74/79/104/175、ACAS-T067-J213 均為CNAS能力驗證樣品;其他用于適用性檢測的大豆及其深加工制品等樣品 均購于市場。

通用型基因組DNA小量制備試劑盒(Koning) 杭州百邁生物股份有限公司;AceTaq?DNA聚合酶(Vazyme)、dNTP mix(10 mM each)、10×PCR Buffer(AceTaq)(Mg2+plus)、PBS 南京諾唯贊生物科技公司;探針與引物 委托美國Invitrogen公司合成;AB7500熒光定量PCR儀 美國ABI公司;NanoDrop 核酸蛋白分析儀 美國Thermo公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 基因組DNA提取 稱取干重樣品40 mg或濕重樣品150 mg,按照基因組DNA提取試劑盒說明書進行操作,加入50 μL滅菌雙重蒸餾水洗脫兩次。提取后取 1 μL 用核酸蛋白分析儀測定提取的基因組 DNA的濃度和純度,用滅菌雙重蒸餾水將所有樣品標定至100 ng/μL,保存于-20 ℃待用。

1.2.2 引物和探針設計 在NCBI網頁檢索轉基因大豆常用外源基因P-35S和T-NOS,根據多重實時熒光PCR檢測引物設計與篩選的原則,使用Primer Express 3.0軟件設計多重引物和熒光探針。探針分別使用熒光基團FAM和Cy5作為發(fā)光基團,使用BHQ作為非熒光淬滅基團。在DNAstar軟件上評價引物和探針的特異性,在BLAST網頁上比對擴增產物的特異性。檢測引物和探針使用滅菌雙重蒸餾水稀釋至10 μmol/L備用。

1.2.3 二重熒光PCR反應 20 μL二重熒光定量PCR反應體系中包括Taq酶,dNTP,基因組DNA以及2組檢測引物和探針等成分(具體見表1)。反應條件設置為95 ℃預變性15 s;95 ℃變性15 s,60 ℃退火延伸1 min,進行40個循環(huán)。定量中設置陰陽性對照、三個復孔的重復實驗和空白對照實驗。陽性對照中使用轉基因陽性的大豆DNA模板,陰性對照中使用轉基因陰性的大豆DNA模板,空白對照中不加DNA模板,而以滅菌蒸餾水代替,用于檢驗是否存在PCR污染和較高的引物二聚體污染。實驗結果應用ABI 7500 software v2.3進行分析處理。

表1 二重熒光定量PCR的反應混合液組成Table 1 Reaction mix for mutiplex real-time PCR systems

1.2.4 特異性檢測 提取ACAS-T067-J213轉基因大豆樣本以及CNAS T025-30非轉基因大豆樣本基因組DNA,使用上述二重熒光定量PCR體系進行轉基因成分檢測與判定,驗證方法的特異性。

1.2.5 靈敏性檢測 提取10% Roundup Ready轉基因大豆樣本基因組DNA,用基因組DNA提取時所用的洗脫液進行梯度稀釋,按照10倍濃度稀釋5個梯度,分別為23.000、2.300、0.230、0.023、0.0023 ng/μL。根據大豆的單倍體基因組分子重量約為1.15 pg[16],稀釋后標準品濃度分別為20000、2000、200、20和2拷貝/μL,對5個梯度的標準品進行二重實時熒光定量反應,每個濃度設置3 個重復,驗證方法的靈敏性。

1.2.6 適用性檢測 采用上述大豆轉基因成分二重熒光定量PCR檢測方法對實驗室收集的轉基因大豆標準品,以及中國合格評定國家認可委員會(CNAS)組織的能力驗證樣品等已知樣品進行檢測,并對市場上購買的大豆及其深加工制品等流通產品,共27個批次進行檢測。同時驗證方法的適用性。

2 結果與分析

2.1 樣品DNA提取結果

提取得到的DNA溶液經核酸蛋白分析儀檢測,OD(260 nm/280 nm)大于1.5,OD(260 nm/230 nm)大于1.0,含量為在100 ng/L以上,純度和提取效率較好。使用0.7% 瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶清晰,完整性好,可用于實時熒光PCR檢測。

圖1 ACAS-T067-J213轉基因大豆樣本以及CNAS T025-30非轉基因大豆DNA提取結果Fig.1 The results of DNA isolation from ACAS-T067-J213 transgenic soybean samples and no-transgenic soybean CNAS T025-30注:1:ACAS-T067-J213; 2:CNAS T025-30;M:1ku DNA Ladder。

2.2 引物和探針特異性檢測

按照1.2.2中的方法針對轉基因大豆常用的P-35S啟動子和T-NOS終止子各設計2～3對引物和探針,探針5′ 熒光染料標記根據所采用的實時熒光PCR儀的配置和熒光基團的發(fā)射光譜或者吸收光譜而定,探針的3′ 淬滅集團為非熒光標記,合成后探針進行擴增驗證,篩選出特異性好的引物和探針用于后續(xù)實驗。篩選的引物和探針信息見表2。

表2 轉基因大豆特異性檢測的引物和探針序列Table 2 The primers and probes of transgenic soya

2.3 特異性檢測結果

使用上述的二重實時熒光定量PCR體系對轉基因大豆陽性樣本和轉基因大豆陰性樣本進行轉基因成分檢測,以驗證方法的特異性。結果表明,在ACAS-T067-J213、CNAS T025-24、CNAS T0659-23、CNAS T0659-79、CNAS T0659-104、CNAS T0659-175等轉基因大豆中外源基因P-35S啟動子和T-NOS終止子檢出,且擴增曲線呈現(xiàn)明顯的S型(其中ACAS-T067-J213轉基因大豆的擴增曲線見圖2)。CNAS T0659-74、CNAS T025-30等非轉基因大豆種子二重熒光PCR檢測中P-35S和T-NOS均未檢出,空白對照均無信號,檢測基因之間無信號干擾,外源基因的反應結果與期望結果一致,表明建立的二重實時熒光PCR具有較好的特異性。

圖2 ACAS-T067-J213轉基因大豆樣本中外源基因P-35S和T-NOS二重熒光PCR反應的擴增曲線圖Fig.2 The amplification plots obtained for simultaneous amplification of P-35S and T-NOS

2.4 靈敏性檢測結果

以拷貝數(shù)的自然對數(shù)值為橫坐標,以循環(huán)數(shù)(Ct值)為縱坐標做外源基因P-35S和T-NOS的標準曲線(圖3),其中R2分別為0.997和0.996。10% Roundup Ready轉基因大豆單重和多重熒光定量PCR檢測相對靈敏性分析見表3,可見本研究建立的二重實時熒光PCR與單重實時熒光PCR的穩(wěn)定性和靈敏性相當。在二重實時熒光PCR檢測中,檢測同一參照樣品重復間Ct值變異較小,外源基因P-35S的Ct值變化范圍在19.23～34.09之間,標準偏差在0.202～0.789之間,擴增效率為93%;外源基因T-NOS的Ct值變化范圍在22.73～35.69之間,標準偏差在0.397～0.910之間,擴增效率為91%,最低檢測限為2拷貝/μL,表明本研究建立的二重實時熒光PCR檢測方法靈敏性較高,能夠滿足篩選檢測轉基因大豆及其制品中轉基因成分的需要。

表3 10% Roundup Ready轉基因大豆單重和多重熒光定量PCR檢測相對靈敏性分析Table 3 The relative sensitivity analyses of single and multiplex qPCR systems used in detention of 10% Roundup Ready transgenic soya reference materials

圖3 10% Roundup Ready transgenic soybean樣品中P-35S和T-NOS基因二重熒光PCR反應的標準曲線圖Fig.3 Standard curves of detected genes of P-35S and T-NOS from 10% Roundup Ready transgenic soybean in duplex qPCR assay

2.5 適用性檢測結果

對采自農貿市場的2批大豆和豆腐、腐竹、老豆干、素雞、腐乳、素肉串、豆奶、豆?jié){、豆腐腦、豆瓣醬、豆卷、板筋等12種大豆制品25個批次樣品,以及實驗室保存的轉基因標準品和能力驗證剩余樣品進行二重實時熒光PCR和內源基因Letin的檢測,其中Letin基因均被檢出,保證了核酸提取的有效性,不會出現(xiàn)假陰性檢測結果。同時按照使用較多的標準SN/T 1204-2003[17]和GB/T 19495.5-2004[18]中規(guī)定的單重實時熒光PCR對外源基因P-35S和T-NOS進行篩選檢測。結果發(fā)現(xiàn)使用建立的二重實時熒光PCR檢測方法,2個批次的大豆樣本中P-35S和T-NOS兩個靶標基因均未檢出,而在其25個批次的大豆制品中只有2個腐竹樣本檢出了兩個靶標基因(見表4),檢出率為7.4%,與標準中的方法檢測結果一致,采自于市場的27個批次的樣本和實驗室保存的9個標準品以及能力驗證剩余樣品均未出現(xiàn)假陽性和假陰性的結果,表明建立的二重實時熒光PCR檢測方法具有很好的適用性。

表4 農貿市場大豆及其制品抽樣檢驗中轉基因檢測陽性結果匯總表Table 4 The summary table of the transgenic positive results of in the soybeans and their products from the farmers markets

3 結論

本研究建立的二重熒光PCR技術可同時對P-35S,T-NOS兩個外源基因進行檢測,為保證方法的準確性,通過了特異性、重復性和靈敏性的驗證,確保了該方法在同時檢測兩個靶標基因時,無熒光信號的相互干擾,不會出現(xiàn)假陰性和假陽性結果;通過對比優(yōu)化實驗,摸索出二重熒光定量PCR檢測的最佳反應體系,擴增效率在90%～110%之間;通過梯度標準品稀釋建立的標準曲線決定系數(shù)R2大于0.98,確定了最低檢測限為2拷貝/μL。通過對27個批次的樣品進行轉基因成分篩選測試,結果與預期的一致,顯示該方法有較好的適用性。開發(fā)和建立的二重熒光定量PCR檢測技術可為大豆及其深加工產品轉基因成分的快速篩選檢測提供了有效方法,可用于口岸和市場流通大豆樣品的篩選檢測。

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