ERK5在大鼠腦梗死和腦出血轉(zhuǎn)化中的激活表達(dá)

][摘要] 目的 觀察持續(xù)性腦缺血及腦出血轉(zhuǎn)化時大鼠腦組織中細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶5（ERK5）的激活表達(dá)情況。方法 Sprague-Dawley大鼠120只，隨機(jī)分為持續(xù)性缺血組、腦出血性轉(zhuǎn)化組、假手術(shù)組，各40例。線栓法建立大鼠大腦中動脈栓塞模型。出血性轉(zhuǎn)化組分別在大腦中動脈栓塞4、8、16、24 h后拔除栓線，再灌注24 h；持續(xù)性缺血組在4、8、16、24 h后不拔除栓線繼續(xù)栓塞24 h。假手術(shù)組手術(shù)過程和時間與出血性轉(zhuǎn)化組相同，但不栓塞大腦中動脈。術(shù)后2 h應(yīng)用BERDERSON評分法評價各組大鼠神經(jīng)功能評分，采用TTC染色法觀察各組大鼠腦梗死及出血情況；Western blotting檢測各組大鼠磷酸化ERK5（p-ERK5）及ERK5的蛋白激活表達(dá)水平。結(jié)果 持續(xù)性缺血組和腦出血性轉(zhuǎn)化組大鼠均表現(xiàn)出不同程度的神經(jīng)功能障礙。TTC染色顯示，腦出血性轉(zhuǎn)化組8、16、24 h時在腦梗死范圍內(nèi)出現(xiàn)了不同程度的出血轉(zhuǎn)化。Western blotting結(jié)果顯示，持續(xù)性缺血組和腦出血性轉(zhuǎn)化組各時間點(diǎn)p-ERK5蛋白表達(dá)量增高，與假手術(shù)組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=37.02～91.85，q=4.58～18.66，P<0.05）。腦出血性轉(zhuǎn)化組8、16、24 h的p-ERK5蛋白表達(dá)量與4 h比較、8、24 h與16 h比較差異均有顯著意義（F=39.47，q=5.90～15.24，P<0.05）。持續(xù)性缺血組8、16、24 h的p-ERK5表達(dá)量較4 h顯著升高，差異有顯著意義（F=7.81，q=4.59～6.46，P<0.05）。3組組內(nèi)不同時間點(diǎn)以及3組間ERK5蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論 大鼠腦缺血及腦出血轉(zhuǎn)化可以誘導(dǎo)ERK5的激活，參與腦缺血與出血轉(zhuǎn)化過程并發(fā)揮重要作用。

[關(guān)鍵詞] 腦缺血；再灌注；出血性轉(zhuǎn)化；絲裂原活化蛋白激酶7；大鼠

[中圖分類號] R743.9

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A

[文章編號] 2096-5532（2018）03-0354-05

腦梗死是臨床上常見的一種神經(jīng)系統(tǒng)疾病，它影響著病人的生活質(zhì)量，甚至可以威脅病人的生命。目前，對于該病的治療，臨床常用方法有溶栓、抗凝和抗血小板等內(nèi)科治療以及血管內(nèi)介入和外科手術(shù)治療[1-2]。而溶栓治療有引發(fā)腦梗死后出血性轉(zhuǎn)化（HT）的可能。HT是臨床上缺血性腦卒中病人的常見并發(fā)癥，歐洲急性卒中協(xié)作小組（ECASS）將出血性轉(zhuǎn)化分為腦實(shí)質(zhì)血腫（PH）和出血性梗死（HI）兩大類型[3]。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路是哺乳動物細(xì)胞內(nèi)普遍存在的一類能夠介導(dǎo)細(xì)胞反應(yīng)的信號系統(tǒng)，該系統(tǒng)能夠?qū)⒓?xì)胞外的刺激信號傳遞到細(xì)胞核內(nèi)，參與細(xì)胞的增殖、分化、轉(zhuǎn)化以及凋亡等，近年來受到越來越多的關(guān)注。目前已經(jīng)確定的MAPK信號通路主要包括以下蛋白：細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK1/2）、P38絲裂原活化蛋白激酶、c-Jun氨基末端激酶和細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶5（ERK5）。ERK5在哺乳動物多種組織中廣泛表達(dá)[4]，在成年小鼠的腦內(nèi)及免疫器官中ERK5也呈高表達(dá)[5]。炎癥是腦梗死的一個關(guān)鍵因素，對HT的發(fā)生有一定的影響，而ERK5可能與炎癥和許多疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。本研究通過線栓法構(gòu)建大鼠出血轉(zhuǎn)化模型，觀察大鼠腦組織ERK5在腦出血轉(zhuǎn)化發(fā)生過程中的激活表達(dá)情況，探討ERK5在腦HT過程中可能的作用及其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠120只，體質(zhì)量250～300 g。隨機(jī)分為假手術(shù)組（A組）、持續(xù)性缺血組（B組）和HT組（C組），各40只。

1.2 模型制備

采用相關(guān)文獻(xiàn)方法[6-7]制備大鼠右側(cè)大腦中動脈栓塞模型：大鼠麻醉后，取仰臥位，剪去頸部皮膚毛發(fā)，沿頸部正中切開皮膚分離皮下組織，分離右側(cè)頸總動脈（CCA）與迷走神經(jīng)，沿CCA向上剝離，暴露大鼠頸內(nèi)動脈（ICA）和頸外動脈（ECA），將近頭端及CCA近心端結(jié)扎，用血管夾夾閉ICA，小心提起CCA，在ECA和ICA分叉處近ECA側(cè)剪一小切口，將線栓（北京西濃科技有限公司）頭部成圓形的一端沿切口緩慢插入ICA，松開ICA處血管夾，待線栓黑色標(biāo)記至ECA和ICA分叉處左右且稍有阻力感時停止進(jìn)線，進(jìn)線深度約2 cm，即可使大腦中動脈阻塞，從而實(shí)現(xiàn)腦缺血。HT組分別在大腦中動脈栓塞4、8、16、24 h后拔除栓線，再灌注24 h；持續(xù)性缺血組在4、8、16、24 h后不拔除栓線繼續(xù)栓塞24 h。假手術(shù)組手術(shù)過程和時間與HT組相同，但栓線插入2 cm左右后隨即拔除，不造成大腦中動脈的栓塞[8]。

1.3 觀察指標(biāo)及方法

1.3.1 神經(jīng)功能評分 采用BEDERSON評分法[9]在大鼠術(shù)后2 h進(jìn)行評分。0分，大鼠無神經(jīng)功能缺失；1分，提起大鼠尾巴，使大鼠懸空，癱瘓側(cè)前肢屈曲或不能徹底伸展，對側(cè)前肢向地面伸展；2分，除1分的體征外，從側(cè)面推大鼠時，大鼠癱瘓側(cè)的抵抗能力較正常側(cè)下降；3分，除2分體征外，大鼠在地上爬行時有明顯的向癱瘓側(cè)轉(zhuǎn)圈的行為。

1.3.2 大鼠腦梗死及出血情況 應(yīng)用2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色法進(jìn)行觀察。各組分別于模型制備后4、8、16、24 h取4只大鼠新鮮腦組織，腦組織取出后立即放入-20 ℃的冰箱中冷凍20 min，然后由前向后連續(xù)等距切成約2 mm厚冠狀切片，將腦片置20 g/L的TTC染色液中37 ℃水浴避光孵育30 min，中途翻動數(shù)次使腦片均勻染色，染完后將腦片置于40 g/L多聚甲醛中固定。正常腦組織會被染成紅色，而梗死組織為白色。

1.3.3 磷酸化ERK5（p-ERK5）及ERK5蛋白激活表達(dá)水平 采用Western blotting方法檢測。各組分別于模型制備后4、8、16、24 h取4只大鼠，麻醉后取新鮮腦組織剪碎后放入預(yù)冷的EP管中，用預(yù)冷的PBS洗3次后離心棄PBS，加入組織蛋白裂解液（裂解液∶100 mmol/L PMSF∶磷酸酶抑制劑=98∶1∶1）勻漿，盡量使組織充分裂解。置于冰上，在冰浴中放置10 min，并每隔5 min渦旋30 s。4 ℃離心（12 000r/min）15 min，將上清液轉(zhuǎn)移到新EP管中，取出部分用BCA法測定蛋白濃度。剩余上清按照1∶4比例加入5×SDS Loading Buffer，渦旋混勻，70 ℃變性10 min，室溫冷卻后，取蛋白樣品30 μg上樣，經(jīng)100 g/L聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電泳結(jié)束后250 mA轉(zhuǎn)膜90 min，然后用50 g/L脫脂奶粉室溫低速搖晃封閉1 h，后分別用p-ERK5抗體（1∶1 000）和總ERK5抗體（1∶1 000）4 ℃孵育過夜。TBST洗滌10 min共3次，加過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG二抗（1∶3 000）室溫孵育1 h，將膜置于ECL顯影液中，掃描成像，得到p-ERK5（相對分子質(zhì)量115 000）、ERK5（相對分子質(zhì)量115 000）以及內(nèi)參β-actin（相對分子質(zhì)量42 000）的蛋白條帶，應(yīng)用Image J圖像分析軟件對蛋白條帶的灰度值進(jìn)行分析，計算出蛋白表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料結(jié)果以[AKx-D]±s表示，多組數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能評分

術(shù)后2 h假手術(shù)組大鼠均未見神經(jīng)功能缺損，神經(jīng)功能評分為0分；持續(xù)性缺血組和HT組都有不同程度的神經(jīng)功能缺損。見表1。

2.2 各組大鼠不同時間點(diǎn)TTC染色比較

正常腦組織呈現(xiàn)紅色，而腦梗死區(qū)域呈現(xiàn)白色。假手術(shù)組未見梗死灶；持續(xù)性缺血組和HT組分別于4、8、16、24 h各取4只神經(jīng)功能評分為3分的大鼠進(jìn)行染色觀察，結(jié)果顯示，持續(xù)性缺血組腦組織出現(xiàn)白色梗死灶，但是未見明顯出血點(diǎn)或紅色血腫，16只大鼠中僅有3只出現(xiàn)了不同程度的出血，發(fā)生率為18.75%；HT組8 h時在白色梗死區(qū)發(fā)現(xiàn)不同程度的血腫形成，而且16 h和24 h血腫發(fā)生率較高，在16只大鼠有12只可見不同程度的血腫出現(xiàn)，發(fā)生率為75.00%。

2.3 各組大鼠p-ERK5與ERK5蛋白表達(dá)量比較

HT組和持續(xù)性缺血組4、8、16、24 h時間點(diǎn)p-ERK5蛋白表達(dá)顯著高于假手術(shù)組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F=37.02～91.85，q=4.58～18.66，P<0.05）；HT組各時間點(diǎn)p-ERK5蛋白表達(dá)量均較持續(xù)性缺血組明顯增高（q=5.64～11.63，P<0.05）。HT組p-ERK5蛋白表達(dá)量隨缺血時間的延長逐漸升高，至16 h時達(dá)到高峰，其中，8、16、24 h與4 h比較、8、24 h與6 h比較差異有顯著性（F=39.47，q=5.90～15.24，P<0.05），而8 h與24 h比較差異無顯著性（P>0.05）。持續(xù)性缺血組8、16、24 h p-ERK5表達(dá)量較4 h顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=7.81，q=4.59～6.46，P<0.05）。假手術(shù)組不同時間點(diǎn)p-ERK5蛋白表達(dá)量差異無顯著性（P>0.05）。3組組內(nèi)不同時間點(diǎn)以及3組間ERK5蛋白表達(dá)量差異無顯著性（P>0.05）。見圖1、表2。

3 討論

HT是缺血性梗死較為常見的并發(fā)癥之一。目前制備HT模型有很多種方法，楊燚等[10]采用兩步法，在建立腦梗死模型的基礎(chǔ)上采用尾動脈血注射的方法建立血腫型梗死后出血轉(zhuǎn)化大鼠模型，此模型可以控制注血量和時間，較為穩(wěn)定且便于觀察，但是這種方法并不能模擬出血轉(zhuǎn)化的病理生理學(xué)機(jī)制，與臨床再灌注的發(fā)生過程有很大差異。也有研究采用rt-PA[11]、肝素[12]、高糖血癥[13]和華法林[14]誘導(dǎo)制備HT模型，此類方法出血部位較為恒定，且臨床相關(guān)性較好。本實(shí)驗(yàn)采用肖潔等[8]血管再通的方法，采用不同時間點(diǎn)拔除栓線的方式準(zhǔn)確控制缺血和再灌注時間，對于再灌注作用和治療時間窗的評價更為方便。本文TTC染色結(jié)果顯示，HT組大鼠腦組織在再灌注8 h即可觀察到出血轉(zhuǎn)化的發(fā)生，且隨著再灌注時間窗的延長，出血轉(zhuǎn)化的發(fā)生率也增高，證明該模型較為成功，且更接近于臨床腦梗死后HT的發(fā)病機(jī)制。

對于缺血性腦卒中來講，血管再通是一個必要的治療方案，但會給病人帶來額外的損傷，并可能引起HT，而且出血率會隨著卒中發(fā)作和血管再通時間的延長而增加[15]。雖然目前關(guān)于HT的治療受到人們廣泛關(guān)注，但有效的治療方案仍然非常有限。因此，我們需要繼續(xù)研究治療HT的有效方法。此外，預(yù)防和預(yù)測HT發(fā)生也至關(guān)重要。

ERK5信號通路是一個新近發(fā)現(xiàn)的MAPK家族成員[16]，也是MAPK通路中的重要組成部分。研究顯示，ERK5是一類高度保守的蘇氨酸（Thr）/酪氨酸（Tyr）蛋白激酶中重要的一級激酶[17]，ERK5在許多組織細(xì)胞中廣泛表達(dá)，主要位于細(xì)胞質(zhì)，由其上游激酶MEK5所激活[16]，也可以被多種刺激因素如高滲壓、低氧、缺血以及某些炎癥因子、神經(jīng)營養(yǎng)因子、表皮生長因子及特定條件流體剪切力[18-20]等激活，而活化后的ERK5可以由胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到胞核。ERK5的c終端區(qū)域包含一個MEF2交互域，它是一個強(qiáng)大的轉(zhuǎn)錄激活域[21]，ERK5可通過自身磷酸化來調(diào)控轉(zhuǎn)錄過程，從而參與細(xì)胞的活動；同時，ERK5的活化形式也可通過c端的物理性結(jié)合作用催化多種胞漿蛋白磷酸化，并可以進(jìn)入核內(nèi)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的活性，發(fā)揮其生物學(xué)功能[22]。

近期有研究在探討膠質(zhì)母細(xì)胞瘤及其他類型的腦腫瘤中ERK5的表達(dá)時發(fā)現(xiàn)，具有高度侵襲性的腦腫瘤如多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中ERK5的表達(dá)呈較高水平[23]。ERK5是一種重要的內(nèi)源性蛋白激酶，它可以調(diào)節(jié)室管膜下區(qū)和嗅球的神經(jīng)形成，ERK5的選擇性激活可以改善人的嗅覺功能[24]。ERK5還可以通過對Akt的調(diào)控進(jìn)而調(diào)節(jié)血小板的活化，參與動脈血栓的形成[25]。另外，在缺血性心肌梗死后，血小板中ERK5的增加會導(dǎo)致血小板的活化，促進(jìn)心室重構(gòu)和收縮功能不全，同時ERK5還可以調(diào)節(jié)部分參與血小板活化的重要蛋白的表達(dá)[26]。在慢性氟中毒時，ERK5可以參與大腦損傷過程，并影響了大腦的學(xué)習(xí)和記憶能力。WANG等[27]研究結(jié)果顯示，腦缺血再灌注損傷可使大鼠海馬CA3/DG區(qū)ERK5激活，而使用ERK5劑量依賴性抑制劑N-乙酰半胱氨酸后，大鼠海馬CA3/DG區(qū)的ERK5蛋白表達(dá)量降低，而且神經(jīng)元的死亡數(shù)目也有增加，提出海馬區(qū)ERK5的激活可以有效減少腦神經(jīng)元的凋亡損傷，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。本研究通過制作大鼠持續(xù)性腦缺血及HT模型研究HT時ERK5激活情況，結(jié)果顯示，持續(xù)性腦缺血組及HT組p-ERK5的表達(dá)量與假手術(shù)組相比均明顯升高，而HT組升高更為顯著，且隨著再灌注時間窗的延長p-ERK5的表達(dá)量越來越高，16 h達(dá)到高峰，而后開始下降，認(rèn)為出血轉(zhuǎn)化損傷可以持續(xù)激活ERK5，從而使其表達(dá)量代償性增高，達(dá)到高峰后才緩慢下降，在出血轉(zhuǎn)化過程中扮演重要的角色；持續(xù)性缺血組8、16、24 h 的p-ERK5表達(dá)量較4 h顯著升高，而8、16、24 h 的p-ERK5表達(dá)量比較無明顯差異，說明腦缺血發(fā)生前期可能引起ERK5的快速激活，隨后基本穩(wěn)定在一個水平。而本文3組大鼠總ERK5的表達(dá)量比較基本沒有差異，說明其p-ERK5表達(dá)增高可能并非是總ERK5蛋白含量的變化所致。

綜上所述，腦HT過程中ERK5被大量激活，參與腦缺血與出血轉(zhuǎn)化過程并發(fā)揮重要作用。但其具體作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究證實(shí)。

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