地佐辛預(yù)處理對全腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)元凋亡作用

[摘要] 目的 研究地佐辛預(yù)處理對全腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)元凋亡的作用及其機制。方法 將48只健康成年雄性Wistar大鼠隨機分為假手術(shù)組（S組）、缺血再灌注組（IR組）和地佐辛預(yù)處理組（D組）。再灌注24 h后取腦組織，采用蘇木精-伊紅染色觀察神經(jīng)元形態(tài)學變化，Western-blot方法測定Caspase-3表達，水溶性四氮唑法測定超氧化物歧化酶（SOD）活性，TUNEL法檢測凋亡細胞陽性率。結(jié)果 與S組比較，其余組凋亡細胞陽性率和Caspase-3表達水平升高，SOD活性下降；與IR組比較，D組凋亡細胞陽性率和Caspase-3表達水平降低，SOD活性升高。差異均有統(tǒng)計學意義（F=4.83～10.66，P<0.05）。結(jié)論 地佐辛預(yù)處理對大鼠腦缺血再灌注神經(jīng)元有保護作用，且其作用機制與抑制Caspase-3生成和減少氧化應(yīng)激相關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 地佐辛；再灌注損傷；腦；細胞凋亡；神經(jīng)保護；大鼠，Wistar

[中圖分類號] R743.33

[文獻標志碼] A

[文章編號] 2096-5532（2018）03-0351-04

在麻醉和手術(shù)過程中，一過性血壓下降及之后的血液再灌注有可能損傷腦內(nèi)某些敏感性神經(jīng)元，影響術(shù)后病人恢復(fù)和生活質(zhì)量，增加住院時間甚至威脅病人的生命安全。研究證明阿片類藥物對心腦等器官缺血再灌注損傷有一定保護作用[1]，其中嗎啡是研究最多的經(jīng)典阿片類藥物，與嗎啡有相同鎮(zhèn)痛效果但副作用明顯減少的地佐辛作為一種新型阿片受體激動拮抗劑成為當前的研究熱點。有研究表明，地佐辛后給藥可減輕大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷引起的神經(jīng)元凋亡，但文獻未涉及地佐辛預(yù)處理對腦細胞的作用，且對地佐辛腦保護作用的機制研究也不全面[2-3]。本研究旨在觀察地佐辛預(yù)處理對大鼠腦缺血再灌注神經(jīng)元凋亡的影響，探討其作用機制，為地佐辛的臨床開發(fā)應(yīng)用提供基礎(chǔ)理論指導，促進地佐辛在腦血管疾病預(yù)防和治療中的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

健康成年雄性Wistar大鼠48只，清潔級，體質(zhì)量為（200±20）g，由青島市實驗動物中心提供。地佐辛注射液（揚子江藥業(yè)），Caspase-3檢測試劑盒、TUNEL試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒、BCA試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所）。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組及模型制備 將48只大鼠隨機分為假手術(shù)組（S組）、缺血再灌注組（IR組）和地佐辛預(yù)處理組（D組），每組16只小鼠。IR組和D組大鼠全腦缺血模型的制備：應(yīng)用100 g/L水合氯醛按3.5 mL/kg體質(zhì)量腹腔注射麻醉大鼠，將大鼠置于俯臥位，在下枕骨后第1～2頸椎部位作皮膚切口，逐層分離組織直至露出位于寰錐橫突兩側(cè)的翼孔，用自制燒灼器反復(fù)灼燒翼孔下走行的椎動脈；然后將大鼠置于仰臥位，于頸正中作切口，輕柔游離出雙側(cè)的頸總動脈并且置線留一活結(jié)，縫合切口后放回籠中飼養(yǎng)；24 h后連腦電圖監(jiān)測，打開切口后用無創(chuàng)動脈夾夾閉兩側(cè)頸總動脈，缺血計時開始，缺血8 min后撤去動脈夾，再灌注開始，縫合切口。S組只暴露翼孔不燒灼椎動脈，兩側(cè)椎動脈只置線不夾閉，其余操作同IR組和D組。缺血前30 min，S組和IR組大鼠腹腔注射生理鹽水0.6 mL，D組大鼠腹腔注射地佐辛注射液0.6 mL（3 mg）。模型制備過程中用白熾燈照射使大鼠肛溫保持在（37.0±0.5）℃。

1.2.2 模型成功的評價 缺血后30～60 s，大鼠出現(xiàn)意識喪失，翻正反射消失，眼球變白，瞳孔變大，腦電圖波形呈直線[4]。不符合上述標準的大鼠剔除并作相應(yīng)補充。

1.3 測定指標

1.3.1 神經(jīng)元形態(tài)學觀察及細胞凋亡檢測 再灌注24 h，每組取8只大鼠，麻醉后以生理鹽水和甲醛固定。斷頭后切取鼠腦，依次經(jīng)固定、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋后，在海馬平面作連續(xù)冠狀切片，片厚5 μm。每只大鼠取3張切片行蘇木精-伊紅（HE）染色，光鏡下觀察記錄神經(jīng)元形態(tài)。每只大鼠取5張連續(xù)切片，按照檢測試劑盒說明書操作，采用TUNEL法檢測神經(jīng)元凋亡情況。在400倍高倍光鏡下每張切片隨機選取海馬區(qū)1個視野計數(shù)陽性細胞（細胞核染色棕黃色者）和陰性細胞，凋亡細胞陽性率=陽性細胞數(shù)/（陽性細胞數(shù)+陰性細胞數(shù)）×100%。

1.3.2 腦組織Casepase-3表達的Western-blot檢測 再灌注24 h，每組取8只大鼠，麻醉后斷頭取腦，將一側(cè)海馬組織制成勻漿，加入裂解液裂解后離心取上清液，用BCA法測定蛋白濃度。取上清液經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)PVDF膜、麗春紅染色、50 g/L脫脂奶粉封閉和兩次抗體孵育。將PVDF膜用發(fā)光試劑顯色后放入顯影儀自動顯影讀取條帶。用Image J軟件測定每條帶的吸光度，以β-actin作為內(nèi)參，計算Casepase-3的相對表達。

1.3.3 腦組織SOD活性測定 再灌注24 h，取鼠腦組織制成10 g/L的海馬組織勻漿，采用水溶性四氮唑法測定SOD活性，按照說明書進行操作，利用底物酶促反應(yīng)測量吸光度（A），計算SOD的活性。SOD活性=SOD抑制率×24/海馬組織蛋白濃度，其中SOD抑制率=[（A對照孔-A對照空白孔-A測定孔+A測定空白孔）/（A對照孔-A對照空白孔）]×100%。

1.4 統(tǒng)計學處理

應(yīng)用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學處理，所得計量資料數(shù)據(jù)以[AKx-D]±s表示，組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 腦組織神經(jīng)元形態(tài)學觀察

光鏡下，S組大鼠腦組織結(jié)構(gòu)清晰，神經(jīng)元排列緊密整齊，胞漿豐富淡染，細胞核居中，核仁清楚，間質(zhì)致密無水腫；IR組神經(jīng)元結(jié)構(gòu)破壞嚴重，大量神經(jīng)細胞胞體皺縮，細胞核固縮，顏色深染，細胞呈三角形或者錐形；D組神經(jīng)元結(jié)構(gòu)破壞較輕，多數(shù)神經(jīng)元胞質(zhì)胞體輕度深染，三角形細胞較少。

2.2 各組凋亡細胞陽性率及SOD活性的比較

與S組比較，IR組、D組凋亡細胞陽性率升高，腦組織的SOD活性下降；與IR組比較，D組凋亡細胞陽性率降低，SOD活性升高，差異均有統(tǒng)計學意義（F=10.66、5.02，P<0.05）。見表1。

2.3 各組腦組織Caspase-3表達比較

與S組比較，IR組、D組腦組織Caspase-3表達水平升高；與IR組比較，D組腦組織Caspase-3的表達水平降低。差異有統(tǒng)計學意義（F=4.83，P<0.05）。見表1、圖1。

3 討論

地佐辛是一種人工合成的新型阿片受體混合激動拮抗劑，其鎮(zhèn)痛效果相當于嗎啡，但副作用明顯減少[5]。地佐辛可以完全激動κ受體，鎮(zhèn)痛作用明確，對μ受體部分激動部分拮抗，降低了傳統(tǒng)阿片藥物呼吸抑制和成癮的可能性[6]，且地佐辛對δ阿片受體作用輕微，病人不易產(chǎn)生煩躁焦慮感[7]。有臨床試驗研究表明，地佐辛誘導麻醉可以使行肺大泡切除術(shù)老年人的血流動力學更加平穩(wěn)，有效預(yù)防或減少嗆咳反應(yīng)[8]。另外，地佐辛還有利于穩(wěn)定行膽囊切除術(shù)糖尿病病人的圍手術(shù)期血糖[9]。本實驗中，與IR組比較，D組大鼠凋亡細胞陽性率和腦組織Casepase-3表達水平顯著降低，光鏡下形態(tài)學損傷減輕。說明地佐辛預(yù)處理可以有效減輕大鼠腦缺血再灌注引起的腦損傷，下調(diào)Caspace-3的表達從而減少凋亡細胞的數(shù)量。

阿片類受體激動劑可抑制腦缺血再灌注損傷造成的神經(jīng)細胞凋亡，通過激動μ、κ、ξ受體發(fā)揮器官保護作用。董河等[10]的研究證實，嗎啡預(yù)處理可減輕腦缺血再灌注后腦損傷，且大劑量效果優(yōu)于小劑量，其機制可能與嗎啡增強bcl-2的表達有關(guān)。王美芳等[11]研究證實，舒芬太尼預(yù)處理對大鼠腦缺血再灌注損傷有保護作用，機制可能與減輕鈣超載有關(guān)。WU等[12]研究表明，另一κ受體激動劑布拖啡諾后處理對大鼠心肌缺血再灌注損傷有保護作用。賈麗玲等[13]研究表明，瑞芬太尼預(yù)處理對大鼠腦缺血再灌注損傷有一定的保護作用，其機制可能與抑制自由基損傷有關(guān)。

Caspase-3是一種重要的凋亡蛋白酶[14]，相對分子質(zhì)量為32 000，屬于半胱氨酸天冬酶家族中的效應(yīng)酶，是凋亡程序級聯(lián)反應(yīng)下游的關(guān)鍵執(zhí)行者，它的激活意味著細胞凋亡已不可逆，因此有“死亡之神”的稱號[3，15-16]，可以作為反映凋亡情況的生化標記物。Caspase-3在腦缺血再灌注后的表達有時間規(guī)律，再灌注24 h時為表達高峰，同時也是細胞凋亡的高峰期[17]。有文獻報道，缺血預(yù)處理可以通過抑制腦缺血再灌注后Caspase-3的表達激活來減少凋亡損傷[18-19]。本研究D組與IR組比較，Caspase-3表達下降，說明地佐辛阻止了凋亡級聯(lián)反應(yīng)，減輕了凋亡程度，對缺血再灌注神經(jīng)元有保護作用。

氧化應(yīng)激是細胞凋亡的重要機制之一[1，20-21]。SOD是機體內(nèi)重要的抗氧化酶，可以反映細胞的氧化應(yīng)激情況。缺血再灌注期間，線粒體的大量破壞使ATP生成減少，細胞無氧代謝產(chǎn)生大量自由基，使腦組織SOD活性下降[22]。本文結(jié)果顯示，D組與IR組比較，腦組織SOD活性升高，說明地佐辛改善了缺血再灌注時神經(jīng)元的氧化應(yīng)激，使損傷減輕。

綜上所述，地佐辛預(yù)處理對大鼠缺血再灌注腦組織有保護作用，可以減輕腦組織的損傷，減少神經(jīng)元凋亡。地佐辛發(fā)揮腦保護作用的機制可能與下調(diào)Caspase-3表達和減少氧化應(yīng)激有關(guān)，從而中止下游的凋亡程序，減少凋亡因子的產(chǎn)生與釋放，抑制神經(jīng)元的凋亡。

[參考文獻]

[1]夏強，錢令波. 心腦缺血再灌注損傷的機制及防治策略研究進展[J]. 浙江大學學報（醫(yī)學版）， 2010，39（6）：551-558.

[2]羅紅鳳. 線粒體ATP敏感性鉀通道及其神經(jīng)保護作用機制的研究進展[J]. 醫(yī)學綜述， 2013，19（20）：3658-3660.

[3]孫岳楓，李波，呂國義. 地佐辛后處理對大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷影響[J]. 中風與神經(jīng)疾病雜志， 2015，32（2）：133-136.

[4]楊文博. 紅景天苷復(fù)合亞低溫對大鼠腦缺血再灌注損傷后細胞凋亡及相關(guān)蛋白表達的影響[D]. 青島：青島大學， 2016.

[5]師小偉，熊源長. 地佐辛臨床鎮(zhèn)痛的研究進展[J]. 醫(yī)學綜述， 2013，19（6）：1105-1107.

[6]WU F X， PAN R R， YU W F， et al. The anti-nociception effect of dezocine in a rat neuropathic pain model[J]. Translational PerioperativePain Medicine， 2014，1（1）：5-8.

[7]耿立成，李麗. 地佐辛藥理及臨床應(yīng)用新進展[J]. 醫(yī)學綜述， 2012，18（23）：4029-4031.

[8]余前土，余曉娟，徐康清，等. 地佐辛預(yù)防老年肺大泡患者全麻誘導期嗆咳反應(yīng)的效果[J]. 廣東醫(yī)學， 2015，36（21）：3277-3279.

[9]騰香芹，茆慶洪，付群，等. 地佐辛對2型糖尿病腹腔鏡膽囊切除術(shù)患者血漿胰島素和血糖的影響[J]. 廣東醫(yī)學， 2015，36（21）：3284-3286.

[10]董河，冀翔宇，王世端，等. 嗎啡預(yù)處理對腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)元凋亡及bcl-2的影響[J]. 中華實驗外科雜志， 2011，28（9）：1597-1598.

[11]王美芳，孟盡海，魏華. 舒芬太尼預(yù)處理對腦缺血再灌注損傷大鼠腦保護功能的影響[J]. 寧夏醫(yī)科大學學報， 2011，33（11）：1023-1025，1032.

[12]WU Y， WAN J， ZHEN W Z， et al. The effect of butorphanol postconditioning on myocardial ischaemia reperfusion injury in rats[J]. Interactive Cardiovascular and Thoracic Surgery， 2014，18（3）：308-312.

[13]賈麗玲，曹定睿，張維智，等. 瑞芬太尼預(yù)處理對腦缺血/再灌注大鼠腦組織MDA含量和SOD活性的影響[J]. 中國醫(yī)藥指南， 2010，8（5）：27-29.

[14]毛德文，陳月橋，王麗，等. Caspase-8及Caspase-3與細胞凋亡[J]. 遼寧中醫(yī)藥大學學報， 2008，10（10）：148-150.

[15]董雅潔，高維娟. bcl-2、bax、caspase-3在細胞凋亡中的作用及其關(guān)系[J]. 中國老年學雜志， 2012，32（21）：4828-4830.

[16]閆鳳霞，高維娟. Caspase-3與腦缺血再灌注損傷[J]. 中國老年學雜志， 2009，29（16）：2119-2121.

[17]葉治，王鍔，潘韞丹，等. 七氟烷預(yù)處理對局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的影響[J]. 中華麻醉學雜志， 2010，30（5）：619-622.

[18]ABOUTALEB N， SHAMSAEI N， RAJABI H， et al. Protection of hippocampal CA1 neurons against ischemia/reperfusion injury by exercise preconditioning via modulation of Bax/Bcl-2 ratio and prevention of caspase-3 activation[J]. Basic and Clinical Neuroscience， 2016，7（1）：21-29.

[19]XIA D Y， LI W， QIAN H R， et al. Ischemia preconditioning is neuroprotective in a rat cerebral ischemic injury model through autophagy activation and apoptosis inhibition[J]. Brazilian Journal of Medical and Biological Research， 2013，46（7）：580-588.

[20]李琳，張志強. 腦缺血再灌注損傷中細胞凋亡的研究進展[J]. 中華物理醫(yī)學與康復(fù)雜志， 2005，27（1）：63-65.

[21]張新勇，王士雯，朱慶磊. 缺血性腦損傷與神經(jīng)細胞凋亡[J]. 老年醫(yī)學與保健， 2006，12（4）：248-250.

[22]江承平，劉福，李毅，等. 參附注射液對腦缺血再灌注大鼠MDA、SOD、TXB-2及6-keto-PGF1a的影響及意義[J]. 中國醫(yī)科大學學報， 2012，41（2）：124-127.