上皮性卵巢癌組織中SMAD4基因突變的檢測

[摘要] 目的 檢測上皮性卵巢癌（EOC）組織中SMAD4基因突變情況，進一步為其個體化治療提供理論依據(jù)。方法 SMAD4基因第1、2、3、4、8、11外顯子在惡性腫瘤中易發(fā)生缺失和突變，卵巢癌中第9外顯子存在非同義突變。收集107例EOC石蠟組織，采用多聚酶鏈式反應（PCR）和Sanger測序篩查第2、8、9、11外顯子基因突變情況。結(jié)果 第2、3外顯子連接處內(nèi)含子結(jié)構(gòu)域發(fā)現(xiàn)1例單核苷酸多態(tài)性；其余外顯子中未發(fā)現(xiàn)突變。結(jié)論 EOC中SMAD4基因第2、8、9、11外顯子突變明顯少見。檢測SMAD4基因突變用于初篩EOC的研究仍需進一步探討。

[關(guān)鍵詞] 卵巢腫瘤；Smad4蛋白質(zhì)；突變；多態(tài)性，單核苷酸

[中圖分類號] R737.31；R349.12

[文獻標志碼] A

[文章編號] 2096-5532（2018）03-0347-04

卵巢癌發(fā)病率位居婦科惡性腫瘤第3位，致死率卻居其首位[1]。確診時多數(shù)病人已為晚期[2]，此時治療手段有限，5年生存率低。因此，早期臨床診斷意義重大。該病以上皮性卵巢癌（EOC）最為常見，占原發(fā)性卵巢惡性腫瘤85%～90%[3]。近10年基因測序已被用于檢測腫瘤體細胞突變，為實體瘤化療耐藥和個體化治療提供理論依據(jù)[4]。因此，從基因水平探索EOC相關(guān)易感基因和突變位點是用于初篩并進行靶向治療的關(guān)鍵進程。SMAD4作為轉(zhuǎn)錄共激活因子在轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）/SMAD通路中扮演重要角色，對提高核內(nèi)SMADs與同源DNA之間吸附力，調(diào)節(jié)細胞增殖、分化、黏附和凋亡過程發(fā)揮重要作用，其異常表達與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。SMAD4在胰腺癌、結(jié)直腸癌、胃癌及肝癌發(fā)生機制已有深入研究[5-8]。國外研究發(fā)現(xiàn)，SMAD4基因外顯子1、2、3、4、8、11在惡性腫瘤中易缺失和突變，其中最常見的突變位點是第8、11外顯子[9]。本研究首次在漢族人群中篩查EOC病人SMAD4基因部分突變熱點，旨在為病人靶向精準治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 一般資料

2012年1月—2016年5月，青島大學附屬醫(yī)院黃島院區(qū)婦科手術(shù)治療原發(fā)性EOC病人107例。病人臨床特征如下。①年齡22～81歲，中位年齡51.5歲。②病理類型：漿液性74例，透明細胞樣11例，黏液性14例，宮內(nèi)膜樣8例。③FIGO分期：Ⅰ期18例，Ⅱ期17例，Ⅲ、Ⅳ期分別63例、9例。④腫瘤分化程度：高分化19例，中分化16例，低分化72例。⑤腫瘤直徑：≥8 cm者70例，<8 cm者37例。⑥腹水：≥500 mL者61例，<500 mL者46例。⑦淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：轉(zhuǎn)移63例（59%），余未轉(zhuǎn)移。病人術(shù)后均給予鉑類為基礎(chǔ)聯(lián)合化療，臨床資料完整。病人的臨床分期及組織分類均符合FIGO卵巢癌、輸卵管癌及腹膜癌分期（2014）指南、WHO（2014）卵巢腫瘤組織學分類標準。本文12例病人術(shù)前行以鉑類為基礎(chǔ)的化療，余未經(jīng)放化療治療。病人均經(jīng)本院病理學專家確診。收集本組病人的EOC組織石蠟標本。

1.2 引物合成

根據(jù)NCBI公開發(fā)表的人類SMAD4序列設(shè)計外顯子2、8、9、11引物，引物由上海Invitrogen公司合成。該基因4個外顯子引物序列見表1。

1.3 抽提卵巢癌石蠟包埋組織DNA

1.3.1 脫蠟 將5～8片5～10 μm厚、1 cm×1 cm大小的石蠟切片裝于1.5 mL無菌離心管中，加入1 mL二甲苯，充分渦旋震蕩10 s。12 000 r/min室溫離心2 min，棄上清。

1.3.2 洗脫二甲苯 上述管中均加入1 mL無水乙醇，渦旋震蕩10 s。12 000 r/min室溫離心2 min，棄上清。重復此步驟1次，確保二甲苯洗脫徹底。室溫放置5～10 min，充分揮發(fā)無水乙醇。

1.3.3 酶解 加入緩沖液GA 200 μL、Proteinase K 20 μL震蕩混勻，56 ℃水浴1 h消化裂解后將其置于90 ℃繼續(xù)水浴1 h。

1.3.4 DNA提取 使用天根石蠟包埋組織DNA提取試劑盒抽提。分光光度計測量DNA濃度與純度，合格DNA置于-20 ℃存貯備用。

1.4 PCR擴增SMAD4第2、8、9、11外顯子

PCR反應體系為20 μL，其中包括DNA 2 μL，Mix 10 μL，雙蒸水7 μL，前向引物與后向引物分別0.5 μL。循環(huán)參數(shù)：預變性94℃、5 min，94℃、30 s，適宜退火溫度30 s，72 ℃、30 s， 35個循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min。分別將這4個外顯子擴增產(chǎn)物經(jīng)15 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定，條帶清晰者經(jīng)切膠回收純化后測其濃度，確保濃度≥50 mg/L。

1.5 基因測序

使用Sanger測序方法對SMAD4基因的4個外顯子PCR擴增產(chǎn)物進行測序。

1.6 突變分析

使用BioEdit（version 7.1.3.0）和DNAMAN（版本 6.0.3.99）軟件讀取基因測序結(jié)果并進行突變分析。

2 結(jié)果

凝膠成像儀電泳結(jié)果表明，107例病人的4個外顯子PCR擴增產(chǎn)物長度分別為575、350、400和358 bp（圖1），PCR擴增目的條帶明確。對擴增成功的產(chǎn)物進行Sanger測序，采用BioEdit軟件對序列圖分析顯示，第2外顯子在大約62 bp的位置出現(xiàn)poly T結(jié)構(gòu)致使后續(xù)測序錯亂（圖2），因此調(diào)整方案對第2外顯子進行反向測序。在1例樣本中發(fā)現(xiàn)單核苷酸多態(tài)性（SNP）（圖3），通過NCBI檢索該SNP位點位于第2和第3外顯子連接處的內(nèi)含子結(jié)構(gòu)域，變異ID和等位基因分別為rs77389132和A/G。另外，我們在ExAC中檢索該SNP染色體位置Chr18：48573689，在人群中基因頻率分布不盡相同：東亞人群為0.039 77，南亞人群0.000 853 1，拉丁美洲人群0.034 15，歐洲芬蘭人群0.000 609 8，歐洲非芬蘭人群0.000 273 3，非洲人群0.000 208 2，上述不均的基因分布表明該SNP 更傾向于發(fā)生在東亞人群。

其余樣本經(jīng)BioEdit分析未發(fā)現(xiàn)雜合突變；使用DNAMAN將測序序列與目的序列進行序列比對，未發(fā)現(xiàn)純合突變。從全部樣本中隨機選取部分標本，進行反向測序驗證，也未發(fā)現(xiàn)突變。

3 討論

經(jīng)典卵巢表面上皮起源學說認為，卵巢癌起源于來自中胚層的卵巢表面生發(fā)上皮，轉(zhuǎn)變?yōu)榕枨婚g皮后具有間葉細胞及上皮細胞特征[10]，通過上皮細胞-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）調(diào)節(jié)排卵后卵巢自我修復。一旦修復過程紊亂則易誘發(fā)細胞惡性轉(zhuǎn)變，此即排卵致癌理論[11]。DAVID等[12]研究認為，TGF-β誘導EMT通常是促使腫瘤發(fā)生途徑。目前相關(guān)研究結(jié)果表明，在結(jié)腸癌、胰腺癌、乳癌、肺癌和前列腺癌等多種腫瘤中存在TGF-β信號傳導失調(diào)[13]。TGF-β/SMAD4介導的信號傳導通路能夠調(diào)節(jié)細胞增殖、分化、黏附和凋亡，進而控制胚胎發(fā)育、組織再循環(huán)和傷口修復，該系統(tǒng)信號傳導及信號因子表達異常與腫瘤的發(fā)生明顯相關(guān)。

關(guān)于人卵巢癌中是否存在SMAD4突變導致TGF-β信號傳導喪失抑制細胞生長的研究較少[14]。目前公認的兩大腫瘤調(diào)控機制：一是DNA序列改變的基因突變，表現(xiàn)為遺傳學調(diào)控；二是DNA序列不改變，但基因表達出現(xiàn)改變的表觀遺傳學機制。本研究針對第一類發(fā)生機制展開研究，結(jié)果未顯示SMAD4基因在第2、8、9、11外顯子區(qū)域基因突變，但發(fā)現(xiàn)1例攜帶SNP rs77389132的病人。至今，該病人無瘤生存2年，那么該SNP位點是否是預后的保護性因素，這需大量樣本研究進一步驗證。雖然關(guān)于SMAD4基因突變發(fā)現(xiàn)較少，但國外研究發(fā)現(xiàn)，在原發(fā)性低級別漿液性卵巢癌中存在SMAD4第9外顯子Chr18：48，591，918C>G，R361G的非同義突變[15]。本文研究結(jié)果未顯示第9外顯子突變，這可能與樣本來源、人種差異亦或腫瘤組織學類型、分化程度有關(guān)。SMAD4表達缺失常見于結(jié)腸癌[16-17]、胰腺癌中[18]，但在卵巢癌中相對罕見，這也可能部分解釋了本實驗未檢測到突變的原因。

SMAD4是TGF-β信號通路中的關(guān)鍵因子，對維持組織穩(wěn)態(tài)并抑制腫瘤發(fā)生發(fā)揮重要作用[19]。SMAD4缺失研究見于上消化道鱗癌、胃腸道腺癌、膽管癌和胰腺癌，在腫瘤發(fā)展中發(fā)揮重要作用[20-21]。國外研究發(fā)現(xiàn)，SMAD4介導的TGF-β信號通路在惡性腫瘤中既發(fā)揮重要始動作用，又可促進腫瘤轉(zhuǎn)移、浸潤[22]。有研究表明，TGF-β受體和SMAD轉(zhuǎn)錄因子在結(jié)腸癌、卵巢癌、食管癌和胰腺癌中突變失活，致使信號傳導失調(diào)，進而影響通路對腫瘤的抑制性[23]。在前列腺增生病人研究中發(fā)現(xiàn)SMAD4雖是腫瘤抑制因子，但同時也具有促進腫瘤生長的作用[24]。ROSS等[25]結(jié)果顯示，卵巢癌中SMAD4蛋白丟失可能與翻譯后修飾特別是泛素化相關(guān)，有待進一步探討。研究也發(fā)現(xiàn)，SMAD4蛋白在人卵巢癌中表達水平下降或缺失，其機制可能與下游通路中DNA結(jié)合力減弱密切相關(guān)[14]。卵巢癌病人術(shù)前SMAD4血清水平明顯高于對照組，且與分化程度、組織學分類、腹水量明顯相關(guān)[26]；而在結(jié)直腸癌研究中，SMAD4表達水平與臨床病理參數(shù)并無明顯差異[27]。另有研究發(fā)現(xiàn)，SMAD4 MH2結(jié)構(gòu)域基因突變的胰腺癌病人預后評估較差[28]；全基因組測序分析表明，高級別漿液性卵巢癌中基因斷裂通常使抑癌基因RB1、NF1、RAD51B和PTEN失活，使病人更易獲得化療耐藥[29]。綜合前人研究，我們猜測SMAD4基因突變是否更可能發(fā)生在漿液性卵巢癌？該基因是否與EOC不良預后及化療耐藥相關(guān)[29]？未來我們可擴大樣本量，采用二代測序法進一步明確SMAD4在卵巢癌中突變情況。隨著精準醫(yī)療的發(fā)展，我們迫切需要發(fā)現(xiàn)驅(qū)動該類型腫瘤發(fā)生發(fā)展的遺傳特征。

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