纈沙坦對球囊損傷大鼠主動脈內(nèi)皮Apelin表達影響

[摘要] 目的 觀察大鼠主動脈球囊損傷后血管組織中Apelin的表達變化及纈沙坦治療對其表達的影響，探討纈沙坦在預(yù)防再狹窄中的作用及其機制。方法 將48只Wistar大鼠隨機分為對照組、手術(shù)組及藥物組，各16只。手術(shù)組和藥物組大鼠用自制的2F球囊導(dǎo)管進行主動脈內(nèi)皮損傷，構(gòu)建大鼠主動脈內(nèi)皮球囊損傷模型；對照組不行主動脈球囊損傷。藥物組術(shù)前1 d～術(shù)后14 d（或28 d）給予纈沙坦（20 mg/（kg·d））進行干預(yù)。各組分別在術(shù)后14、28 d取主動脈組織，應(yīng)用蘇木精-伊紅染色觀察血管內(nèi)膜的變化，實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)、免疫組織化學(xué)方法檢測主動脈組織Apelin的mRNA和蛋白表達水平。結(jié)果 術(shù)后14、28 d手術(shù)組血管內(nèi)膜較對照組顯著增厚，藥物組內(nèi)膜厚度較手術(shù)組明顯降低，差異有顯著性（F=168.85、233.62，P<0.05）。手術(shù)組內(nèi)皮損傷后14、28 d主動脈組織Apelin mRNA和蛋白表達較對照組顯著升高，藥物組Apelin mRNA和蛋白表達較手術(shù)組明顯增加，差異有顯著性（F=26.74～48.71，P<0.05）。結(jié)論 大鼠主動脈球囊損傷后血管組織中Apelin的表達升高，纈沙坦抑制主動脈球囊損傷后內(nèi)膜增生可能與其上調(diào)Apelin的表達有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 球囊損傷；Apelin；纈沙坦；冠狀動脈再狹窄

[中圖分類號] R563.1

[文獻標志碼] A

[文章編號] 2096-5532（2018）03-0334-04

經(jīng)皮冠狀動脈介入（PCI）術(shù)是目前公認治療冠狀動脈狹窄病變的有效手段[1]，但術(shù)后存在再狹窄的并發(fā)癥，嚴重影響了PCI的療效。藥物涂層支架的引入和新型抗栓藥物的應(yīng)用有效降低了再狹窄的發(fā)生，但其發(fā)生率仍達5%[2-3]。為了進一步改善病人的長期預(yù)后，提高病人的生存質(zhì)量，預(yù)防再狹窄的發(fā)生尤為重要。研究結(jié)果證實，血管平滑肌細胞的移行和增殖是發(fā)生動脈粥樣硬化和PCI術(shù)后再狹窄的主要病理學(xué)基礎(chǔ)。血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑（ARB）在降壓、改善心肌重構(gòu)等心血管疾病的治療中發(fā)揮著重要作用。既往研究顯示，纈沙坦可以通過抑制血管平滑肌細胞的移行及增殖，減輕血管內(nèi)皮損傷后內(nèi)膜的增生，降低術(shù)后再狹窄的發(fā)生[4]。Apelin是血管緊張素Ⅱ1型受體相關(guān)蛋白APJ的內(nèi)源性配體[5]，廣泛表達于體內(nèi)的各種組織器官中。

近年來，Apelin在心血管疾病中的作用日益得到人們的關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，Apelin在原發(fā)性高血壓、心力衰竭病人的血漿中表達降低[6]，藥物洗脫支架植入24 h后血漿Apelin的表達較支架植入前明顯升高[7]。然而，關(guān)于Apelin在內(nèi)皮損傷后血管組織中的變化尚未見報道。本實驗通過觀察血管內(nèi)皮損傷后Apelin的表達變化及纈沙坦治療對其表達的影響，探討纈沙坦抑制大鼠主動脈球囊損傷后內(nèi)膜增生的作用及其機制，為再狹窄的預(yù)防提供更多的理論依據(jù)?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料和方法

1.1 實驗分組及處理

正常飲食的雄性Wistar大鼠48只，購自青島市實驗動物中心，將其隨機分為對照組、手術(shù)組和藥物組，各16只。手術(shù)組：腹腔注射100 g/L的水合氯醛（3 mL/kg）麻醉大鼠，從大鼠左側(cè)頸總動脈插入自制的2F球囊導(dǎo)管，并緩慢行至腹主動脈下端，以0.08～0.10 mL無菌氯化鈉溶液充盈球囊，從不同方向抽拉導(dǎo)管3次，充分剝脫大鼠主動脈內(nèi)膜。藥物組：手術(shù)操作與手術(shù)組相同，術(shù)前1 d～術(shù)后14 d（或28 d）給予大鼠纈沙坦（20 mg/（kg·d））溶于2 mL生理鹽水）灌胃。對照組：除不插入球囊進行損傷，其他處理同手術(shù)組。

1.2 標本采集及處理

各組分別在術(shù)后14、28 d取大鼠主動脈血管，每組各時間點均取8只。經(jīng)腹腔注射100 g/L的水合氯醛（3 mL/kg）全身麻醉大鼠，置入體積分數(shù)0.75乙醇中浸泡5 s，在超凈臺中無菌條件下剪取長約5 cm的主動脈血管段，取近主動脈弓端約5 mm的血管置入40 g/L甲醛溶液中固定，制作石蠟切片。其余的主動脈血管放入-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 組織學(xué)檢測

石蠟切片行蘇木精-伊紅（HE）染色及免疫組化檢查。光鏡下觀察HE切片中血管平滑肌細胞移行、增殖以及內(nèi)膜的變化，應(yīng)用Simple PCI圖像分析儀測量內(nèi)膜和中膜的厚度[8]。

1.4 血管組織中Apelin mRNA表達測定

應(yīng)用Trizol試劑（美國，Invitrogen公司）提取血管組織中總RNA，檢驗其純度。應(yīng)用RT-PCR試劑盒（德國Rothe公司）逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。逆轉(zhuǎn)錄條件：37 ℃、55 min；85 ℃、10 min；-20 ℃儲存。根據(jù)SYBR Premix Ex Taq（大連寶生物公司）說明書在Light Cycler Real Time PCR擴增儀上進行SYBR Green I實時定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件如下：95 ℃、10 s，60 ℃、10 s，72 ℃、15 s，共40個循環(huán)。Apelin及內(nèi)參照β-actin的引物序列及產(chǎn)物長度見表1。以β-actin為管家基因，應(yīng)用2-△△Ct法計算目的基因mRNA 的相對表達量[9]。

1.5 血管組織中Apelin蛋白表達檢測

應(yīng)用免疫組化法檢測血管組織中Apelin的蛋白表達。主動脈組織石蠟切片，依次經(jīng)二甲苯脫蠟、乙醇水化、內(nèi)源性過氧化物酶阻斷滅活，抗原修復(fù)，加入Apelin一抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）稀釋液（稀釋比例為1∶45），PBS沖洗、二抗孵育漂洗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水，透明，干燥，封片。應(yīng)用Simple PCI圖像分析軟件隨機測定高倍鏡下5個不同區(qū)域Apelin的蛋白表達量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料結(jié)果以[AKx-D]±s形式表示，多組數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD方法。以P<0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 各組主動脈組織學(xué)觀察

主動脈內(nèi)皮球囊損傷術(shù)后14、28 d，手術(shù)組內(nèi)膜厚度較對照組顯著增加，藥物組內(nèi)膜厚度較手術(shù)組明顯降低，差異有顯著性（F=168.85、233.62，P<0.05）。手術(shù)組術(shù)后14 d內(nèi)膜中可見大量增殖和移行平滑肌細胞，大部分的創(chuàng)傷面被內(nèi)皮細胞覆蓋，內(nèi)膜增厚；術(shù)后28 d，幾乎全部的創(chuàng)傷面被內(nèi)皮細胞覆蓋，平滑肌細胞增殖作用減輕，細胞外基質(zhì)明顯增加，內(nèi)膜進一步增厚。藥物組大鼠術(shù)后14、28 d主動脈血管平滑肌細胞的移行及增殖能力較手術(shù)組明顯減弱，內(nèi)膜增生明顯減輕。見表2。

2.2 各組主動脈血管組織中Apelin mRNA表達比較

球囊損傷主動脈內(nèi)皮術(shù)后14、28 d，手術(shù)組血管組織的Apelin mRNA相對表達量較對照組明顯升高，藥物組Apelin mRNA相對表達量較手術(shù)組明顯升高，差異有顯著性（F=38.36、48.71，P<0.05）。見表3。

2.3 各組主動脈血管組織中Apelin蛋白表達比較

Apelin蛋白表達于內(nèi)皮細胞及平滑肌細胞的胞膜和胞漿中，為棕黃色顆粒。手術(shù)組14 d及28 d的Apelin蛋白表達均明顯高于對照組，藥物組均明顯高于手術(shù)組，差異有顯著意義（F=26.74、35.29，P<0.05）。見表3。

3 討論

PCI術(shù)后再狹窄是局部血管受損引起的一種自我過度修復(fù)反應(yīng)[10]，主要包括血管的彈性回縮、血管重塑、血栓的形成與機化、平滑肌細胞的移行及增殖、炎性反應(yīng)、細胞外基質(zhì)沉積、各種細胞因子的釋放[11-13]。通過植入支架可以解決血管的彈性回縮及血管重塑的問題[14]，但無法限制血管平滑肌細胞的增殖，因而難以避免術(shù)后再狹窄的發(fā)生。

Apelin是近年來發(fā)現(xiàn)的一種生物活性多肽，通過與其受體APJ 結(jié)合，而發(fā)揮正性肌力、改善心肌肥厚、降壓、促血管內(nèi)皮生成、抗動脈粥樣硬化的作用[15-17]。Apelin和AngⅡ具有一定的同源性，均屬于血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（ACE2）的催化底物[18]。已有研究發(fā)現(xiàn)，Apelin與APJ結(jié)合后，可以促進APJ-AT1異質(zhì)二聚體的形成，從而使AT1受體與AngⅡ的親和力降低[19-20]，抑制AngⅡ的生物學(xué)效應(yīng)。SATO等[21]的研究顯示，體內(nèi)Apelin 是ACE2的正性調(diào)控因子，可促進ACE2的表達及生物活性。ACE2可高效催化AngⅡ轉(zhuǎn)為Ang-（1-7），在體內(nèi)可以發(fā)揮抗氧化、抗炎、抗纖維化、抗血栓及抗動脈粥樣硬化的作用[22-23]。Apelin/APJ系統(tǒng)和ACE2是AngⅡ-AT1R的內(nèi)源性拮抗劑，對心血管系統(tǒng)起到保護作用[24]。給予心力衰竭病人體內(nèi)快速輸注Apelin，可以提高病人的心排血量，改善心功能[25]。此外，Apelin 可以通過減少泡沫細胞的脂質(zhì)沉積以及增加血管中NO的表達，從而抑制由AngⅡ引起的動脈粥樣硬化[26]。

本實驗通過建立球囊損傷主動脈內(nèi)皮模型，模擬術(shù)后再狹窄。研究結(jié)果顯示，在主動脈內(nèi)皮球囊損傷術(shù)后 14 d及28 d，內(nèi)膜明顯增厚，血管組織中的Apelin表達水平升高，提示Apelin與再狹窄有一定的關(guān)系。Apelin作為血管保護性因子，當血管內(nèi)皮損傷后，通過增加其表達，拮抗AngⅡ等引起的血管平滑肌的移行及增殖作用，但這種保護作用相對較弱，難以完全抵抗內(nèi)膜的增生，因而內(nèi)皮損傷后內(nèi)膜仍明顯增厚。血管內(nèi)皮損傷后，Apelin的表達升高是一種血管保護性反應(yīng)，此結(jié)果與支架植入術(shù)后24 h血漿中Apelin的表達升高一致。

ARB可競爭性結(jié)合AT1受體，抑制AngⅡ的作用，從而減輕血管內(nèi)皮損傷后的過度修復(fù)反應(yīng)，抑制平滑肌的遷移和增殖，減輕內(nèi)膜的增生[27]。纈沙坦作為臨床一線用藥的ARB類藥物，可高選擇性結(jié)合AT1受體，纈沙坦涂層支架可通過抑制內(nèi)膜的增生，預(yù)防支架內(nèi)再狹窄的發(fā)生[28]。本實驗結(jié)果顯示，給予纈沙坦治療14 d及28 d，球囊損傷大鼠主動脈血管平滑肌細胞的移行及增殖能力較手術(shù)組明顯減弱，內(nèi)膜增生明顯減輕；Apelin的表達水平較手術(shù)組明顯升高。提示大鼠主動脈損傷后，纈沙坦不僅可以競爭性地與AT1受體結(jié)合，抑制AngⅡ介導(dǎo)的促平滑肌細胞的移行及增殖作用，還可能通過上調(diào)Apelin的表達，促進Apelin和APJ的結(jié)合，增加APJ-AT1R二聚體的形成，進一步降低AngⅡ和AT1受體的結(jié)合，抑制其促平滑肌細胞增殖及遷移能力。此外，Apelin水平升高促進了ACE2的表達及活性，而高表達的ACE2可催化AngⅡ生成Ang-（1-7），使血管重構(gòu)進一步減輕。

綜上所述，纈沙坦可減輕大鼠主動脈球囊損傷后內(nèi)膜增厚，其機制可能與其上調(diào)Apelin的表達有關(guān)。具體作用機制有待深入研究。此外，Apelin可能成為未來預(yù)防再狹窄的一個重要靶點，為PCI術(shù)后再狹窄的預(yù)防指明新的方向。

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