經NF—κB通路調節(jié)骨橋蛋白表達對骨關節(jié)炎滑膜細胞炎癥影響

[摘要] 目的 探討經核因子kappa B（NF-κB）通路調節(jié)骨橋蛋白（OPN）表達對人膝關節(jié)滑膜炎的影響。方法 收集20例原發(fā)性膝關節(jié)骨關節(jié)炎（OA）病人滑膜標本（OA組），以因膝關節(jié)內骨折行急癥手術、半月板或韌帶損傷3 d內手術病人滑膜標本15例作為對照組。采用免疫組化法觀察兩組膝關節(jié)滑膜中OPN及NF-κB通路相關蛋白的表達；體外分離培養(yǎng)獲取成纖維滑膜細胞，采用Western blot方法檢測膝關節(jié)成纖維滑膜細胞中OPN及NF-κB通路中p65、磷酸化p65（p-p65）、IκBα和磷酸化IκBα（p-IκBα）的表達。結果 與對照組比較，OA組滑膜炎癥明顯。免疫組化顯示，OA組滑膜組織中OPN表達明顯高于對照組，NF-κB信號通路激活，差異有統(tǒng)計學意義（t=4.796～16.980，P<0.05）。Western blot檢測顯示，OA組成纖維滑膜細胞中OPN、p65、p-p65、p-IκBα表達較對照組顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義（t=3.351～16.980，P<0.05）；而兩組通路抑制蛋白IκBα表達差異無顯著性（P>0.05）。結論 OA滑膜增生與炎癥可能與NF-κB信號通路激活介導的OPN的表達有關。

[關鍵詞] 骨橋蛋白質；NF-κB；滑膜細胞；骨關節(jié)炎

[中圖分類號] R684.3

[文獻標志碼] A

[文章編號] 2096-5532（2018）03-0325-05

骨關節(jié)炎（OA）是骨科最常見的一類以關節(jié)退行性變和滑膜、軟骨增生為特征的慢性關節(jié)疾病，主要表現為關節(jié)疼痛、腫脹、僵硬、畸形以及功能障礙等[1]，嚴重危害中老年人的健康。WHO數據顯示，65歲以上人群中約10%男性和18%女性患有不同程度的OA[2]，其中膝關節(jié)OA在65歲以上人群中致殘率最高[3]。以往觀點認為，關節(jié)軟骨生物力學和化學因素改變導致OA[4-5]，但最新研究發(fā)現滑膜病理改變可能是影響OA的重要因素[6]。骨橋蛋白（OPN）是一種廣泛存在于人體組織中的多功能磷酸化蛋白，參與多種生理及病理過程。有研究顯示，OPN在OA關節(jié)滑膜、滑液及關節(jié)軟骨中表達的明顯高于正常對照組，且與疾病嚴重程度呈正相關關系[7]。GAO等[8]的研究結果表明，OA病人滑液及關節(jié)軟骨中OPN表達顯著增高，且OPN水平與OA的Kellgren-Lawrence 影像學分級呈正相關，但其具體機制尚不清楚。核因子kappa B（NF-κB）作為轉錄因子蛋白家族成員之一，在調節(jié)免疫應答和炎癥反應中起關鍵作用[9-10]。NF-κB的不正確調控與癌癥、炎癥和自身免疫性疾病、感染性休克、病毒感染和免疫發(fā)育異常有關。相關研究證實，NF-κB蛋白家族在OA滑膜組織、成纖維滑膜細胞、關節(jié)液及周圍肌肉中高表達[11-12]。CHEN等[13]研究顯示，抑制大鼠膝關節(jié)炎模型NF-κB基因表達可以明顯減輕實驗性OA早期的關節(jié)破壞和緩解滑膜炎癥。本文研究OA病人膝關節(jié)成纖維滑膜細胞中OPN及NF-κB通路相關蛋白表達，探討OA滑膜中OPN的表達是否與激活NF-κB信號通路產生的下游炎性效應相關，從而為治療OA疾病提供新的思路。

1 資料和方法

1.1 一般資料

2017年6—10月，選取于我院行人工膝關節(jié)表面置換術OA病人20例，男8例，女12例；年齡60～78歲，中位年齡68歲。納入標準：符合中華醫(yī)學會骨科分會《骨關節(jié)炎診斷指南（2015）》膝OA診斷標準[14]。對照組選取同期因膝關節(jié)內骨折行急癥手術、半月板或韌帶損傷3 d內手術病人滑膜標本15例，男9例，女6例；年齡21～43歲，中位年齡34.5歲；病人無全身慢性炎性疾病。

1.2 實驗方法

1.2.1 滑膜組織蘇木精-伊紅（HE）染色和免疫組化染色 兩組標本以40 g/L甲醛溶液固定，經HE染色后，光鏡下觀察滑膜組織炎癥改變。用免疫組化法檢測兩組滑膜組織內OPN與NF-κB相關蛋白p65、IκBα的表達，免疫熒光觀察滑膜組織內磷酸化p65（p-p65）染色情況，顯微鏡下觀察滑膜組織內各蛋白染色情況并采集圖像，應用Image J圖像分析軟件測定OPN與NF-κB相關蛋白染色區(qū)域的像素值。

1.2.2 Western blot法檢測滑膜細胞中OPN與通路蛋白p65、p-P65、IκBα及磷酸化IκBα（p-IκBα）表達 術中收集滑膜標本置于加有雙抗的無菌生理鹽水中，2 h內送至實驗室處理，進行成纖維滑膜細胞培養(yǎng)和觀察。在無菌操作臺將滑膜組織標本用含雙抗的PBS溶液反復漂洗3次，去除脂肪及壞死組織，將標本剪成約1 mm×1 mm×1 mm大小組織塊，加入2倍體積Ⅱ型膠原酶，恒溫箱中消化2 h。離心去除含雜質的上清液，加入胰酶混勻恒溫箱中消化20 min，加入等體積滑膜培養(yǎng)液終止消化，200目曬網過濾收集細胞懸液，離心棄上清，加入4～5 mL培養(yǎng)液，混勻轉移至細胞培養(yǎng)瓶，37 ℃、含體積分數0.05 CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24 h后吸去懸浮細胞，貼壁細胞即為原代滑膜細胞。每3～5 d換液1次，傳至第3代，應用Vimentin檢測成纖維滑膜細胞，陽性率達到98%后提取細胞蛋白。以2.5 g/L胰蛋白酶消化獲取貼壁細胞，加入等量培養(yǎng)基終止消化后吸至10 mL的EP管中，1 000 r/min離心5 min后去除上清，加入預冷的PBS液3 mL洗滌吹打，離心棄上清液加入1 mL的PBS液洗滌并轉移至1.5 mL的EP管再次離心去上清，PMSF和細胞裂解液按照1∶100比例混合（同樣比例加入磷酸酶抑制劑），置于冰上裂解滑膜細胞30 min。4 ℃高速離心機12 000 r/min離心15 min。將兩組細胞裂解液轉移至新EP管，計液體量。提取蛋白，以BCA法檢測滑膜細胞蛋白濃度，加入待測樣本1/4體積的buffer煮沸10 min，配制濃度為100 g/L的SDS-PAGE分離膠以及50 g/L的濃縮膠，80 V電泳30 min、120 V電泳1.5 h，轉至PVDF膜（冰浴，2 h），50 g/L脫脂奶粉室溫封閉2 h，按最佳滴度分別添加兔抗OPN、兔抗p65、兔抗p-p65、兔抗IκBα及兔抗p-IκBα孵育2 h或4 ℃過夜，TBST沖洗10 min共3次，辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔抗體室溫孵育1～2 h，TBST沖洗后加顯影液顯像。Image J軟件分析各蛋白條帶灰度值，以β-actin蛋白為內參，以獲得的蛋白灰度值表示目的蛋白表達。

1.3 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學處理，計量數據以[AKx-D]±s表示，數據間比較采用兩獨立樣本t檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組滑膜組織炎性改變比較

HE染色光鏡下觀察可見，對照組滑膜內襯細胞形態(tài)正常，排列整齊，間質無炎性細胞浸潤，血管正常分布。OA組滑膜內襯層增生明顯，嚴重者呈絨毛狀增生，細胞水腫、排列紊亂，呈嗜酸性，部分呈嗜堿性；間質血管增生紊亂，大量炎性細胞浸潤，間質纖維化。

2.2 兩組滑膜組織OPN與p65、IκBα蛋白染色結果比較

免疫組化結果顯示，兩組滑膜組織細胞胞質中均有OPN表達，對照組表達強度較弱，而OA組滑膜組織OPN像素值明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（t=4.991，P<0.05）；OA組NF-κB通路蛋白p65和IκBα染色強度較對照組增強，像素值明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（t=4.796、16.980，P<0.05）。見圖1和表1。免疫熒光檢測顯示，對照組滑膜細胞核內無明顯熒光染色，OA病人滑膜細胞核內通路蛋白p-p65呈綠色熒光，OA組滑膜細胞內NF-κB通路蛋白p-p65在細胞核內高表達。

2.3 細胞培養(yǎng)結果

光鏡下觀察，兩組成纖維滑膜細胞（第3代）均呈梭形，兩極有細長胞突，條索交織呈網狀，可見部分不規(guī)則多邊形或星形細胞，正?；ぜ毎^OA組滑膜細胞細長，形態(tài)較規(guī)則。細胞免疫化學染色結果顯示，第4代滑膜細胞呈梭形或多角形，胞周有短小突起；核大呈圓形或卵圓形，位于細胞中央，核仁明顯。Vitmentin陽性，符合成纖維樣滑膜細胞免疫組化特點。

2.4 兩組滑膜細胞中OPN與通路蛋白p65、p-P65、IκBα及p-IκBα表達比較

Western blot分析結果顯示，OA組滑膜細胞OPN、NF-κB亞基p65、p-p65以及p-IκBα蛋白表達顯著高于對照組，差異有顯著性（t=3.351～16.980，P<0.05）；兩組細胞內NF-κB抑制蛋白IκBα的表達差異無顯著性（P>0.05）。見圖2、3。

3 討論

OA是骨科最常見的一種以關節(jié)退變和滑膜、軟骨增生為特征的慢性關節(jié)疾病，與年齡等多種因素相關，常表現為關節(jié)軟骨的退行性變和繼發(fā)性骨質增生。傳統(tǒng)的觀念認為，關節(jié)內生物力學改變和生化因素導致關節(jié)軟骨破壞，從而產生OA[4-5]；然而最新研究結果表明，滑膜病理改變可能導致關節(jié)軟骨退變，因此滑膜炎癥也許是OA發(fā)病的始動環(huán)節(jié)[15-16]。SANDELL等[17]通過遺傳分析和全基因組篩查研究顯示，OA相關基因與滑膜關節(jié)發(fā)育過程有關。因此，OA的滑膜炎癥及其產生機制，逐漸成為研究熱點。

OPN是一種富含絲氨酸、谷氨酸和天冬氨酸的多功能磷酸化糖蛋白，廣泛分布于細胞外間質、骨組織和炎癥部位，參與多種疾病發(fā)展和細胞活動過程。通過特殊位點的OPN磷酸化，與一系列細胞表面受體（整合素及CD44等）結合，激活細胞通路，調節(jié)多種細胞因子的表達與分泌，調控細胞黏附、趨化、凋亡以及腫瘤細胞的侵襲、遷移等多種生理病理過程[18-19]。既往研究顯示，OA病人滑液中OPN蛋白及mRNA水平較正常人明顯升高[20]。GAO等[21]研究表明，細胞內OPN的表達水平與關節(jié)軟骨改變和滑膜增生以及OA的嚴重程度密切相關，可作為判斷膝關節(jié)OA病情進展的有效指標。WANG等[22]認為通過靶向抑制OPN的表達和滑膜增殖是治療OA的一種有效手段。

相關研究證實，NF-κB蛋白家族存在于多種細胞中，在OA滑膜組織、成纖維滑膜細胞、關節(jié)液及周圍肌肉中高表達[11-12]。通過NF-κB通路的細胞外信號傳導，調節(jié)多種基因表達，參與細胞的免疫應答、炎癥反應、細胞凋亡以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展等[23]。其機制如下：在未受刺激的情況下，胞內NF-κB二聚體被κBs的抑制劑（IκB）隔離在細胞質中，IκB重復作用于被核定位信號蛋白掩蓋的NF-κB通路，抑制其激活[24]。經NF-κB信號通路介導的上游的信號分子激活該通路時，IκB磷酸化導致蛋白酶體靶向降解，NF-κB蛋白被釋放。隨后，NF-κB相關蛋白被移入細胞核中，并開啟擁有啟動子和其他位點的NF-κB結合原件的特異性基因表達。LI等[25]研究顯示，軟骨細胞中OPN和NF-κB通路蛋白高表達，通過抑制NF-κB通路，其下游基質金屬蛋白酶MMP13表達量下降。FRANKE等[26]研究顯示，活化的NF-κB信號通路與滑膜成纖維細胞增生有關，從而促進OA進展。因此我們猜測，通過NF-κB信號通路介導的OPN的表達對膝關節(jié)成纖維滑膜細胞炎癥及增殖有顯著影響，進一步影響OA的病情發(fā)生與進展。

本文研究檢測正常膝關節(jié)與OA病人滑膜組織中OPN蛋白和NF-κB信號通路蛋白的表達情況。HE染色顯示，相對于對照組，OA組滑膜內襯層增生明顯，嚴重者呈絨毛狀增生，細胞水腫、排列紊亂，多呈嗜酸性，部分呈嗜堿性；間質血管增生紊亂，大量炎性細胞浸潤，間質纖維化。說明OA病人滑膜組織發(fā)生形態(tài)改變。GATTORNO等[27]研究顯示，OPN與特發(fā)性關節(jié)炎滑膜組織血管生成相關。推測OA的滑膜炎癥，包括滑膜細胞增生、炎性浸潤和血管增生與OPN的表達相關。本實驗免疫組化及免疫熒光結果表明，兩組滑膜組織中均有OPN表達，但OA組滑膜組織中OPN蛋白染色區(qū)域較對照組顯著增加。p65和IκBα是NF-κB通路中的重要蛋白，在正常細胞內均有一定表達。本文結果顯示，OA組NF-κB通路蛋白染色較對照組明顯增強，其中IκBα介導細胞信號向核內傳導，IκBα蛋白表達顯著增多，NF-κB通路介導信號向核內傳導。p-p65是由上游信號導致的p65磷酸化的結果，其磷酸化后向核內轉移。本文免疫熒光檢查顯示，OA滑膜細胞內NF-κB通路蛋白p-p65在細胞核內高表達，提示通路處于激活狀態(tài)，p65磷酸化進入細胞核，并可能通過特定基因的表達或抑制表達，產生下游效應，提示OA滑膜炎癥可能與NF-κB通路激活有關。本文成纖維滑膜細胞傳代培養(yǎng)與Western blot檢測結果表明，OA組NF-κB通路相關蛋白p65、p-p65和p-IκBα表達較對照組增高，差異有統(tǒng)計學意義，而兩組細胞內抑制蛋白IκBα表達差異無統(tǒng)計學意義，提示NF-κB信號通路激活，可能與OA進展程度相關。

綜上所述，OA病人膝關節(jié)滑膜中OPN的表達較正常人升高，并且OPN可通過激活胞內NF-κB信號通路影響核內基因表達，進一步導致膝關節(jié)滑膜炎性改變，從而影響膝關節(jié)炎的發(fā)生與發(fā)展。本研究尚缺乏基因水平的驗證，是本研究的不足之處。另外，NF-κB信號通路下游信號分子較多以及OPN磷酸化位點的不同，產生的滑膜變化需繼續(xù)研究，從而進一步揭示OA滑膜細胞通過NF-κB通路介導的OPN表達調控的具體分子機制。

[參考文獻]

[1]BIJLSMA J W， BERENBAUM F， LAFEBER F P. Osteoarthritis： an update with relevance for clinical practice[J]. Lancet， 2011，377（9783）：2115-2126.

[2]WOOLF A D， PFLEGER B. Burden of major musculoskeletal conditions[J]. Bulletin of the World Health Organization， 2003，81（9）：646-656.

[3]HUNTER D J， NEVITT M， LOSINA E， et al. Biomarkers for osteoarthritis： current position and steps towards further validation[J]. Best Practice Research Clinical Rheumatology， 2014，28（1）：61-71.

[4]PETROW P K， HUMMEL K M， SCHEDEL J， et al. Expression of osteopontin messenger RNA and protein in rheumatoid arthritis： effects of osteopontin on the release of collagenase 1 from articular chondrocytes and synovial fibroblasts[J]. Arthritis and Rheumatism， 2000，43（7）：1597-1605.

[5]ROSENTHAL A K， GOHR C M， UZUKI M， et al. Osteopontin promotes pathologic mineralization in articular cartilage[J]. Matrix Biology： Journal of the International Society for Matrix Biology， 2007，26（2）：96-105.

[6]BENITO M J， VEALE D J， FITZGERALD O， et al. Synovial tissue inflammation in early and late osteoarthritis[J]. Annals of the Rheumatic Diseases， 2005，64（9）：1263-1267.

[7]HONSAWEK S， TANAVALEE A， SAKDINAKIATTI-KOON M， et al. Correlation of plasma and synovial fluid osteopontin with disease severity in knee osteoarthritis[J]. Clinical Biochemistry， 2009，42（9）：808-812.

[8]GAO S G， LI K H， ZENG K B， et al. Elevated osteopontin level of synovial fluid and articular cartilage is associated with disease severity in knee osteoarthritis patients[J]. Osteoarthritis and Cartilage， 2010，18（1）：82-87.

[9]PAHL H L. Activators and target genes of Rel/NF-kappa B transcription factors[J]. Oncogene， 1999，18（49）：6853-6866.

[10]HAYDEN M S， GHOSH S. Signaling to NF-κB[J]. Genes Development， 2004，8（18）：2195-2224.

[11]DEVIN A， COOK A， LIN Y， et al. The distinct roles of TRAF2 and RIP in IKK activation by TNF-R1： TRAF2 recruits IKK to TNF-R1 while RIP mediates IKK activation[J]. Immunity， 2000，12（4）：419-429.

[12]MOYNAGH P N. The NF-kappa B pathway[J]. Journal of Cell Science， 2005，118（20）：4589-4592.

[13]CHEN L X， LIN L， WANG H J， et al. Suppression of early experimental osteoarthritis by in vivo delivery of the adenoviral vector-mediated NF-kappa B p65-specific siRNA[J]. Osteoarthritis and Cartilage/OARS， Osteoarthritis Research Society， 2008，16（2）：174-184.

[14]MCALINDON T， BANNURU R， SULLIVAN M， et al. Response to letter to the editor entitled “comments on OARSI guidelines for the non-surgical management of knee osteoarthritis”[C]. Proceedings， 2014：128-133.

[15]LUGO L， VILLALVILLA A， GOMEZ R， et al. Effects of PTH [1-34] on synoviopathy in an experimental model of osteoarthritis preceded by osteoporosis[J]. Osteoarthritis and Cartilage， 2012，20（12）：1619-1630.

[16]HOFF P， BUTTGEREIT F， BURMESTER G R， et al. Os-teoarthritis synovial fluid activates pro-inflammatory cytokines in primary human chondrocytes[J]. International Orthopaedics， 2013，37（1）：145-151.

[17]SANDELL L J. Etiology of osteoarthritis： genetics and syno-vial joint development[J]. Nature Reviews Rheumatology， 2012，8（2）：77-89.

[18]STANDAL T， BORSET M， SUNDAN A. Role of osteopontin in adhesion， migration，cell survival and bone remodeling[J]. Experimental Oncology， 2004，26（3）：179-185.

[19]EL-TANANI M K. Role of osteopontin in cellular signaling and metastatic phenotype[J]. Frontiers in Bioscience， 2008，13（13）：4276-4284.

[20]HASEGAWA M， SEGAWA T， MAEDA M， et al. Thrombin-cleaved osteopontin levels in synovial fluid correlate with disease severity of knee osteoarthritis[J]. The Journal of Rheumatology， 2011，38（1）：129-134.

[21]GAO S G， CHENG L， ZENG C， et al. Usefulness of specific OA biomarkers， thrombin-cleaved osteopontin， in the poste-

rior cruciate ligament OA rabbit model[J]. Osteoarthritis and Cartilage， 2013，21（1）：144-150.

[22]WANG Q Y， WANG W C， ZHANG F， et al. NEAT1/miR-181c regulates osteopontin （OPN）-Mediated synoviocyte proliferation in osteoarthritis[J]. Journal of Cellular Biochemistry， 2017，118（11）：3775-3784.

[23]REN W K， YIN J， DUAN J L， et al. Mouse intestinal innate immune responses altered by enterotoxigenic Escherichia coli （ETEC） infection[J]. Microbes and Infection， 2014，16（11）：954-961.

[24]REN W K， YIN J， ZHU X P， et al. Glutamine on intestinal inflammation： a mechanistic perspective[J]. European Journal of Inflammation， 2013，11（2）：315-326.

[25]LI Y S， JIANG W， WANG H， et al. Osteopontin promotes expression of matrix metalloproteinase 13 through NF-κB signaling in osteoarthritis[J/OL]. Biomed Res Int， 2016， 2016：6345656. doi：10.1155/2016/6345656.

[26]FRANKE S， SOMMER M， RSTER C， et al. Advanced glycation end products induce cell cycle arrest and proinflammatory changes in osteoarthritic fibroblast-like synovial cells[J]. Arthritis Research Therapy， 2009，11（5）： R136.

[27]GATTORNO M， GREGORIO A， FERLITO F， et al. Synovial expression of osteopontin correlates with angiogenesis in juvenile idiopathic arthritis[J]. Rheumatology （Oxford， England）， 2004，43（9）：1091-1096.