ANO1抑制劑對自發(fā)性高血壓大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響

[摘要] 目的 探討鈣激活氯通道ANO1抑制劑T16A（inh）-A01（A01）對自發(fā)性高血壓大鼠血管平滑肌細(xì)胞（SHR-VSMC）增殖的影響。方法 取SHR-VSMC及其對照WKY大鼠的血管平滑肌細(xì)胞（WKY-VSMC），均分為對照組（加入體積分?jǐn)?shù)為0.001的DMSO）和A01處理組（分別加入濃度為1、5、10、20 μmol/L的A01）。采用MTT法檢測各組細(xì)胞存活率，Western blot法檢測各組增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）表達(dá)，觀察A01對細(xì)胞增殖能力的影響。結(jié)果 MTT結(jié)果顯示，與WKY-VSMC對照組比較，SHR-VSMC對照組的生長速度明顯加快（t=3.702，P<0.01）。與SHR-VSMC對照組比較，A01處理組的細(xì)胞存活率呈劑量依賴性下降，其中10、20 μmol/L A01的抑制作用比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=9.916，q=4.468～7.483，P<0.01）。Western blot結(jié)果顯示，與WKY-VSMC對照組相比，SHR-VSMC對照組的PCNA表達(dá)水平顯著升高（t=2.871，P<0.01），A01（20 μmol/L）處理24 h后，SHR-VSMC的PCNA表達(dá)部分被抑制（t=2.064，P<0.01）。結(jié)論 ANO1抑制劑能明顯抑制 SHR-VSMC的異常增殖。

[關(guān)鍵詞] ANO1；肌細(xì)胞，平滑?。患?xì)胞增殖；大鼠，近交SHR

[中圖分類號] R544.1

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A

[文章編號] 2096-5532（2018）03-0317-04

高血壓血管重構(gòu)（VR）是長期的高血壓造成血管結(jié)構(gòu)和功能的改變，其特征性表現(xiàn)為阻力血管管壁增厚、管腔縮小、中膜厚度/管腔內(nèi)徑比值增加[1]。高血壓血管重構(gòu)不僅參與高血壓的發(fā)生和發(fā)展，也是其靶器官損傷（如冠心病、腦卒中）的重要病理生理學(xué)基礎(chǔ)[2-3]。高血壓血管重構(gòu)發(fā)病機(jī)制極其復(fù)雜，而血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）異常增殖、凋亡和遷移通常被認(rèn)為是高血壓VR的中心環(huán)節(jié)[4-6]，因此抑制VSMC的異常增殖是防治高血壓VR的重要策略。鈣激活氯離子通道（CaCC）是心血管系統(tǒng)的一種重要離子通道，研究結(jié)果已證明CaCC的分子基礎(chǔ)是TMEM16A/ANO1[7-9]。VSMC的ANO1激活促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)氯離子外流和細(xì)胞膜除極，從而激活電壓依從性鈣通道，引起胞外鈣內(nèi)流和血管收縮。最新研究顯示，ANO1在自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）動脈組織和VSMC的功能性表達(dá)明顯增加，抑制內(nèi)源性ANO1可明顯降低血壓[10-13]。但在SHR的VSMC（SHR-VSMC）上高表達(dá)的 ANO1是否參與細(xì)胞的異常增殖則較少有文獻(xiàn)報道。本文研究應(yīng)用原代培養(yǎng)的SHR-VSMC，觀察特異性ANO1抑制劑T16A（inh）-A01（A01）對細(xì)胞增殖的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

選擇8～10周齡SHR及其對照WKY大鼠，雄性，體質(zhì)量200～250 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。動物置于12 h-12 h 晝夜光照條件下適應(yīng)1周，取胸主動脈進(jìn)行原代培養(yǎng)。

1.2 主要試劑和儀器

ANO1抑制劑A01購自美國Sigma公司，用二甲基亞砜（DMSO）配制成濃度10 mmol/L儲備液。DMEM高糖培養(yǎng)基購自Gibco公司，胎牛血清購自美國Hyclone公司，四甲基偶氮唑鹽（MTT）購自美國Sigma公司，增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）抗體購自Cell Signaling Technology公司，β-actin抗體購自北京博奧森公司，HRP-標(biāo)記的二抗購自Santa Cruz公司，BCA蛋白定量檢測試劑盒購自Thermo公司，RIPA裂解液購自碧云天生物技術(shù)研究所，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。所用儀器包括CO2培養(yǎng)箱、Olympus倒置相差顯微鏡、Spectra Max M5多功能酶標(biāo)儀、Western顯影儀等。

1.3 VSMC的原代培養(yǎng)

采用組織貼塊法進(jìn)行VSMC的原代培養(yǎng)[14-17]。將SHR和WKY大鼠腹腔注射400 mg/kg水合氯醛麻醉后，迅速取出胸主動脈，用眼科剪縱向剖開血管壁，刮除內(nèi)皮細(xì)胞層，剪成約1 mm×1 mm×1 mm大小組織塊，均勻貼在細(xì)胞培養(yǎng)瓶底。加入含有體積分?jǐn)?shù)0.20的胎牛血清和體積分?jǐn)?shù)0.01雙抗的DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)1周后可見VSMC爬出組織塊，約2周后進(jìn)行消化傳代，取5～10代細(xì)胞用于實驗。

1.4 MTT法檢測細(xì)胞存活率

取對數(shù)生長期細(xì)胞，以每孔200 μL接種于96孔板，每孔5 000～10 000個細(xì)胞，細(xì)胞貼壁后更換為無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。SHR-VSMC和WKY-VSMC均分為對照組（加入體積分?jǐn)?shù)為0.001的DMSO）和A01處理組（分別加入1、5、10、20 μmol/L的A01）。藥物處理結(jié)束后，每孔加入5 g/L的MTT 20 μL繼續(xù)培養(yǎng)4 h， 棄上清液，再加入150 μLDMSO溶解的藍(lán)色甲瓚顆粒，應(yīng)用酶標(biāo)儀測定波長570 nm處吸光度（A）值。設(shè)定對照組A為100%，計算各實驗組的細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率（%）=（實驗組A/對照組A）×100%。每組實驗均重復(fù)6次，取其均值。

1.5 Western blot 法檢測PCNA

分別取對數(shù)生長期細(xì)胞，以每孔1.5 mL接種于6孔板，每孔25 000～50 000個細(xì)胞。對照組加入含體積分?jǐn)?shù)0.001 DMSO的DMEM培養(yǎng)液，A01處理組加入終濃度為20 μmol/L的A01培養(yǎng)24 h。藥物處理結(jié)束后，提取蛋白，BCA法測定蛋白濃度，每孔20 μg蛋白上樣，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)移至PDVF膜。將膜放入50 g/L BSA封閉液封閉1 h，再分別加入PCNA抗體（1∶2 000）或β-actin抗體（1∶10 000），4 ℃孵育過夜。TBST洗膜后以HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，ECL發(fā)光劑顯影。用Image J軟件對蛋白條帶進(jìn)行半定量分析，結(jié)果以PCNA/β-actin比值表示。每組實驗重復(fù)6次。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 11.0及PPMS 1.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料結(jié)果以[AKx-D]±s表示，兩組均數(shù)間比較采用t檢驗；3組以上均數(shù)間比較采用單因素方差分析（ANOVA），用Turkey法進(jìn)行兩兩比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 A01對細(xì)胞存活率的影響

與WKY-VSMC對照組相比，SHR-VSMC對照組細(xì)胞生長速度明顯加快（t=3.702，P<0.01）。A01 （1、5、10、20 μmol/L） 處理SHR-VSMC后，細(xì)胞存活率呈劑量依賴性下降，其中10、20 μmol/L A01處理組和SHR-VSMC對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=9.916，q=4.468～7.483，P<0.01）。但是各個濃度A01處理對WKY-VSMC細(xì)胞存活率無明顯影響（P>0.05）。見表1。

2.2 A01對PCNA表達(dá)的影響

WKY-VSMC對照組以及SHR-VSMC對照組大鼠的PCNA表達(dá)水平分別為0.90±0.26、1.20±0.33，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.871，P<0.01），由此推測SHR-VSMC的增殖能力較WKY-VSMC對照組增強(qiáng)。20 μmol/L A01處理SHR-VSMC 24 h后，其PCNA表達(dá)水平降低至0.98±0.25（t=2.064，P<0.01）。A01對WKY-VSMC的PCNA表達(dá)無明顯的抑制作用（P>0.05）。見圖1。

3 討論

VSMC的異常增殖和遷移是高血壓VR的中心環(huán)節(jié)。高血壓時的血流壓力和剪切力增加、血管活性物質(zhì)（如Ang Ⅱ[18]）、各種炎性因子和生長因子（如TGF-β，IGF-1，EGF）以及離子通道異常均可促進(jìn)VSMC的異常增殖，促進(jìn)VR的發(fā)生[19]。因此，抑制VSMC的異常增殖，是防治高血壓VR的重要策略。

TMEM16A/ANO1是新發(fā)現(xiàn)的CaCC，廣泛分布于心臟和各種血管組織（如胸主動脈、頸動脈、腦動脈、肺動脈、腸系膜動脈及門靜脈）[20]。ANO1在細(xì)胞增殖和遷移中發(fā)揮重要作用[21-22]。前期研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)ANO1蛋白或抑制ANO1功能可抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖[23-25]。有研究表明，抑制ANO1可降低HNSCC、ESCC、乳癌和前列腺癌細(xì)胞的存活能力[12，24，26]。此外，特異性敲除ANO1能抑制小鼠Cajal間質(zhì)細(xì)胞從G1期向S期的過渡[27]。因此，ANO1被認(rèn)為是一種細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)因子。但是關(guān)于ANO1對VSMC增殖的影響，不同研究結(jié)果并不一致。WANG等[11]研究顯示，抑制ANO1功能后，血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的腸系膜動脈VSMC增殖能力降低。另有研究顯示，高表達(dá)ANO1能夠抑制血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的基底動脈VSMC的增殖[28]。我們的前期研究結(jié)果也顯示，SHR大鼠的血管組織和原代培養(yǎng)的VSMC中ANO1表達(dá)明顯增加，但是ANO1高表達(dá)是否影響VSMC增殖，還需要進(jìn)一步探討。

PCNA與細(xì)胞DNA合成關(guān)系密切，在細(xì)胞增殖的啟動上起重要作用，是反映細(xì)胞增殖狀態(tài)的良好指標(biāo)。本研究通過檢測VSMC的細(xì)胞存活率及PCNA的表達(dá)，觀察了特異性ANO1抑制劑T16A（inh）-A01對原代培養(yǎng)的VSMC增殖的影響。結(jié)果顯示，與WKY-VSMC對照組相比，SHR-VSMC對照組細(xì)胞的增殖速度明顯加快，該變化可以被ANO1抑制劑所拮抗。在某些腫瘤細(xì)胞如乳癌細(xì)胞中，ANO1高表達(dá)可通過激活MAPK信號通路、鈣調(diào)蛋白依賴的蛋白激酶及表皮細(xì)胞生長因子受體（EGFR）通路而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移[29]。已有研究顯示，應(yīng)用 RNA 干涉下調(diào)ANO1蛋白表達(dá)或者利用 A01 抑制ANO1的通道功能，均可導(dǎo)致原代培養(yǎng)的SHR-VSMC細(xì)胞內(nèi)鈣下降，推測A01抑制SHR-VSMC異常增殖的作用可能與降低細(xì)胞內(nèi)鈣水平有關(guān)。

綜上所述，ANO1抑制劑能顯著抑制VSMC的異常增殖。在后續(xù)實驗中，我們將對其可能機(jī)制做進(jìn)一步探討。

[參考文獻(xiàn)]

[1]MISRKOV E， BEHULIAK M， BENCZE M， et al. Excitation-contraction coupling and excitation-transcription coupling in blood vessels： their possible interactions in hypertensive vascular remodeling[J]. Physiological Research， 2016，65（2）：173-191.

[2]ZHANG M J， FENG Z Y， HUANG R， et al. Characteristics of pulmonary vascular remodeling in a novel model of Shunt-associated pulmonary arterial hypertension[J]. Medical Science Monitor， 2018，24：1624-1632.

[3]NARANJO D， ARKUSZEWSKI M， RUDZINSKI W， et al. Brain ischemia in patients with intracranial hemorrhage： pathophysiological reasoning for aggressive diagnostic management[J]. The Neuroradiology Journal， 2013，26（6）：610-628.

[4]SUN H J， LIU T Y， ZHANG F， et al. Salusin-beta contri-

butes to vascular remodeling associated with hypertension via promoting vascular smooth muscle cell proliferation and vascular fibrosis[J]. Biochimica et Biophysica Acta-Molecular Basis of Disease， 2015，1852（9）：1709-1718.

[5]BELO V A， GUIMARAES D A， CASTRO M M. Matrix metalloproteinase 2 as a potential mediator of vascular smooth muscle cell migration and chronic vascular remodeling in hypertension[J]. Journal of Vascular Research， 2015，52（4）：221-231.

[6]CASTRO M M， TANUS-SANTOS J E. Inhibition of matrix metalloproteinases （MMPs） as a potential strategy to ameliorate hypertension-induced cardiovascular alterations[J]. Current Drug Targets， 2013，14（3）：335-343.

[7]PANG C L， YUAN H B， REN S X， et al. TMEM16A/B as-sociated CaCC： structural and functional insights[J]. Protein and Peptide Letters， 2014，21（1）：94-99.

[8]CHERKASHIN A P， KOLESNIKOVA A S， TARASOV M V， et al. Expression of calcium-activated chloride channels Ano1 and Ano2 in mouse taste cells[J]. Pflugers Archiv： European Journal of Physiology， 2016，468（2）：305-319.

[9]TIEN J， LEE H Y， MINOR J， et al. Identification of a dime-rization domain in the TMEM16A calcium-activated chloride channel （CaCC）[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2013，110（16）：6352-6357.

[10]SEO Y， LEE H K， PARK J， et al. Ani9， a novel potent small-molecule ANO1 inhibitor with negligible effect on ANO2[J]. PLoS One， 2016，11（5）： e0155771.

[11]WANG B X， LI C L， HUAI R T， et al. Overexpression of ANO1/TMEM16A， an arterial Ca2+-activated Cl- channel， contributes to spontaneous hypertension[J]. Journal of Mole-cular and Cellular Cardiology， 2015，82（5）：22-32.

[12]SEO Y， PARK J， KIM M， et al. Inhibition of ANO1/TMEM16A chloride channel by idebenone and its cytotoxicity to cancer cell lines[J]. PLoS One， 2015，10（7）： e0133656.

[13]OH S J， HWANG S J， JUNG J， et al. MONNA， a potent and selective blocker for transmembrane protein with unknown function 16/anoctamin-1[J]. Molecular Pharmacology， 2013，84（5）：726-735.

[14]KIM S A， SUNG J Y， WOO C H， et al. Laminar shear stress suppresses vascular smooth muscle cell proliferation through nitric oxide-AMPK pathway[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications， 2017，490（4）：1369-1374.

[15]江蕓，林有東，徐如梅，等. 白細(xì)胞介素-10對大鼠胸主動脈血管平滑肌細(xì)胞遷移的影響[J]. 中國老年學(xué)雜志， 2016，36（21）：5232-5234.

[16]鄭華峰，陶晶，張斌，等. MicroRNA-124抑制大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖及分子機(jī)制研究[J]. 中國心血管雜志， 2016，21（1）：50-54.

[17]李慧，李超民，劉薇，等. 阿齊沙坦對轉(zhuǎn)化生長因子誘導(dǎo)的自發(fā)性高血壓大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖及遷移的影響[J]. 心腦血管病防治， 2014，14（4）：274-276，283.

[18]HE D H， LIN J X， ZHANG L M， et al. Early treatment with losartan effectively ameliorates hypertension and improves vascular remodeling and function in a prehypertensive rat[J]. Life Sciences， 2017，173：20-27.

[19]FANG H， CHEN W， GAO Y， et al. Molecular mechanisms associated with angiotensin-converting enzyme-inhibitory peptide activity on vascular extracellular matrix remodeling[J]. Cardiology， 2014，127（4）：247-255.

[20]DAVIS A J， FORREST A S， JEPPS T A， et al. Expression profile and protein translation of TMEM16A in murine smooth muscle[J]. Am J Physiol Cell Physiol， 2010，299（5）： C948-C959.

[21]SHIWARSKI D J， SHAO C， BILL A， et al. To“grow” or “go”： TMEM16A expression as a Switch between tumor growth and metastasis in SCCHN[J]. Clinical Cancer Research， 2014，20（17）：4673-4688.

[22]BILL A， GUTIERREZ A， KULKARNI S， et al. ANO1/TMEM16A interacts with EGFR and correlates with sensitivity to EGFR-targeting therapy in head and neck cancer[J]. Oncotarget， 2015，6（11）：9173-9188.

[23]LIU W， LU M， LIU B G， et al. Inhibition of Ca（2+）-activated Cl- Channel ANO1/TMEM16A expression suppresses tumor growth and invasiveness in human prostate carcinoma[J]. Cancer Letters， 2012，326（1）：41-51.

[24]BRITSCHGI A， BILL A， BRINKHAUS H， et al. Calciu-mactivated chloride channel ANO1 promotes breast cancer progression by activating EGFR and CAMK signaling[J]. Proc Natl Acad Sci U S A， 2013，110（11）： E1026-E1034.

[25]JIA L H， LIU W， GUAN L Z， et al. Inhibition of Calcium-activated chloride channel ANO1/TMEM16A suppresses tumor growth and invasion in human lung cancer[J]. PLoS One， 2015，10（8）： e0136584.

[26]SHI Z Z， SHANG L， JIANG Y Y， et al. Consistent and differential genetic aberrations between esophageal dysplasia and squamous cell carcinoma detected by array comparative genomic hybridization[J]. Clinical Cancer Research， 2013，19（21）：5867-5878.

[27]YANG M C， YU P C， TU M S， et al. Effects of endothelin and vasopressin on portal pressure of rats[J]. Life Sciences， 1990，46（26）：1929-1936.

[28]WANG M， YANG H， ZHENG L Y， et al. Downregulation of TMEM16A Calcium-activated chloride channel contributes to cerebrovascular remodeling during hypertension by promoting basilar smooth muscle cell proliferation[J]. Circulation， 2012，125（5）：697.

[29]DUVVURI U， SHIWARSKI D J， XIAO D， et al. TMEM16A induces MAPK and contributes directly to tumorigenesis and cancer progression[J]. Cancer Research， 2012，72（13）：3270-3281.