機械張力加載時間對成纖維細胞機械傳導效應影響

[摘要] 目的 探討加載機械張力參數(shù)為拉伸幅度的10%時，機械張力的加載時間對正常皮膚成纖維細胞（NSFB）機械傳導效應的影響。方法 體外培養(yǎng)人體NSFB和增生性瘢痕成纖維細胞（HSFB），NSFB和HSFB分別設實驗組和對照組，實驗組加載機械張力參數(shù)為拉伸幅度10%，對照組不加載機械張力。在加載周期性機械張力3、5、7 d時，用CCK-8檢測各組細胞增殖能力，用Real-time PCR法檢測各組細胞Integrin-β1、P130Cas基因表達水平，用Western-Blot方法檢測細胞Integrin-β1、P130Cas蛋白表達水平。結果 加載機械張力5 d時，NSFB實驗組與HSFB對照組比較，細胞增殖、P130Cas和Integrin-β1的表達水平差異均無統(tǒng)計學意義（Z=-0.218，F(xiàn)=0.591、0.079，P>0.05）；加載3、7 d時，NSFB實驗組與HSFB對照組比較，細胞增殖、P130Cas、Integrin-β1表達差異均有統(tǒng)計學意義（Z=-5.294～-2.411，F(xiàn)=34.182～872.148，P<0.05）。結論 拉伸幅度為10%的機械張力加載5 d時，可使NSFB表現(xiàn)出與HSFB相同的機械傳導效應。

[關鍵詞] 成纖維細胞；瘢痕；皮膚；機械感受器；整合素類

[中圖分類號] R329.24；R339.19

[文獻標志碼] A

[文章編號] 2096-5532（2018）03-0313-05

增生性瘢痕的形成與機械張力密切相關[1]。通過加載適當大小的機械張力，正常皮膚成纖維細胞（NSFB）中的整合素信號通路被激活，細胞機械傳導效應增強，細胞增殖與分化改變，最終表現(xiàn)出增生性瘢痕成纖維細胞（HSFB）表型[2-4]。目前，皮膚成纖維細胞力學信號的傳導和生化反應機制尚未明確；細胞只有在感受到適當大小、作用時間的機械張力時才會發(fā)生明顯的信號傳導，引起細胞內生化反應。前期研究證實，皮膚成纖維細胞的機械張力加載最佳幅度為10%[5]。為進一步探究使成纖維細胞發(fā)生機械信號傳導的最佳參數(shù)，本實驗通過對比不同加載機械張力（加力）時間下NSFB與HSFB的生化反應及細胞增殖能力，探究使NSFB表現(xiàn)出與HSFB相同機械傳導效應的最佳時間，確定使成纖維細胞發(fā)生機械信號傳導的準確實驗參數(shù)，從而為研究機械張力導致瘢痕形成機制提供實驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑

多通道細胞應力加載儀（BF-3001C，美國Flex-cell公司），6孔彈性基底膜培養(yǎng)板（BF-3001C，美國Flex-cell公司）；ABI ViiATM 7 SYBR Green qPCR儀（美國ABI公司）；化學發(fā)光成像系統(tǒng)（美國AL-PHA FCE公司）。

MEM培養(yǎng)基（美國CORNING公司），EDTA -胰蛋白酶、FBS（美國Gibco公司）； Trizol（美國Sigma公司），反轉錄及熒光定量PCR試劑盒（大連寶生物公司）；Integrin-β1、P130Cas及GAPDH的PCR引物（上海生工生物有限公司）； PVDF膜、ECL發(fā)光液（美國Millipore公司）；P130Cas、Integrin-β1兔抗人單克隆抗體（英國Abcam公司）。

1.2 細胞培養(yǎng)與分組

隨機選擇青島大學附屬醫(yī)院美容整形外科增生性瘢痕病人3例，男1例，女2例，年齡分別為18、37、41歲。診斷均符合增生性瘢痕診斷標準[6]。病人均知情同意。分別取病人的瘢痕組織及正常皮膚組織標本，采用組織塊培養(yǎng)法分別體外培養(yǎng)NSFB和HSFB，取第3～8代細胞進行實驗。同一例病人NSFB和HSFB分別設實驗組和對照組。將細胞均勻接種于6孔彈性基底膜培養(yǎng)板，置于37 ℃、含體積分數(shù)0.05的CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)，光鏡下觀察細胞融合度達30%后，給予實驗組細胞加力。設定加力參數(shù)為拉伸幅度10%，加力頻率0.1 Hz，加力波形為正弦波；根據(jù)加力的總時間分為3 d組、5 d組和7 d組，按照細胞應力加載儀說明書，連續(xù)加力4 h后停止1 h；加力時環(huán)境仍為37 ℃、體積分數(shù)為0.05的CO2、飽和濕度。對照組不加力，僅進行正常培養(yǎng)。細胞均每2 d每孔補充體積分數(shù)為0.10血清培養(yǎng)液0.5 mL。

1.3 檢測指標

1.3.1 CCK-8方法檢測細胞的增殖水平 在加力第3、5、7天，各組分別取3孔細胞，各加入CCK-8試劑200 μL，將試劑混勻后于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h。各孔取200 μL的細胞培養(yǎng)液于96孔板中，空白孔為MEM，用酶聯(lián)免疫檢測儀檢測在450 nm波長處吸光度（A）值。

1.3.2 Real-time PCR檢測P130Cas、Integrin-β1的基因表達水平 各組取3孔細胞，Trizol提取細胞總RNA，進行逆轉錄反應，采用Real-time PCR法檢測P130Cas、Integrin-β1的mRNA表達水平。反應體系含有：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 10 μL、ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μL、PCR的前后引物各0.8 μL，ddH2O 6 μL，cDNA 溶液2 μL，總體系為20 μL。應用 ABI ViiATM 7 SYBR Green qPCR儀進行擴增，反應參數(shù)為：以 95 ℃、30 s，95℃、5 s，60 ℃、30 s重復45個循環(huán)。應用ABI ViiATM7軟件對反應產(chǎn)物的溶解曲線進行自動定量分析。以GAPDH為內參，所用引物及其序列見表1。用相對定量法計算各目的基因的mRNA含量，即根據(jù)Ct值計算2-△△Ct值。△△Ct=（Ct目的-Ct內參）-（Ct對照-Ct內參）。

1.3.3 Western-Blot檢測Integrin-β1、P130Cas蛋白表達量 各組取3孔細胞，加入以100∶1比例制成的蛋白裂解液與蛋白酶抑制劑混合劑，冰上裂解細胞30 min，提取總蛋白，用BCA試劑盒測定蛋白濃度，加入1/4樣品體積量的Loading Buffer，95 ℃金屬浴5 min，-20 ℃保存?zhèn)溆谩DS-PAGE電泳。切取凝膠后，用濕轉法轉膜。Integrin-β1、P130Cas一抗稀釋濃度為1∶5 000；內參選用β-actin，稀釋濃度1∶1 500；二抗稀釋濃度1∶10 000。一抗4 ℃孵育過夜，二抗常溫孵育2 h后浸ECL發(fā)光液于化學發(fā)光成像系統(tǒng)中顯影。用Image J 圖像分析系統(tǒng)測定蛋白條帶的灰度值，以灰度值和條帶面積的乘積（IntDen）進行半定量分析。蛋白相對表達量=實驗組（IntDen目的-IntDen內參）/對照組（IntDen目的-IntDen內參）。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。細胞增殖水平為方差不齊非正態(tài)分布計量資料，組間比較用秩和檢驗；Integrin-β1、P130Cas的表達水平以[AKx-D]±s表示，組間、組內比較采用重復測量設計的方差分析。以P<0.05為差異有顯著性。

2 結果

2.1 不同加力時間對細胞增殖的影響

各組細胞增殖能力隨加載時間延長呈上升趨勢；加力3、5和7 d時，HSFB實驗組細胞增殖能力高于HSFB對照組，NSFB實驗組細胞增殖能力高于NSFB對照組，HSFB增殖能力高于NSFB，差異均有顯著性（Z=-5.294～-2.411，P<0.05）；其中加力5 d時，NSFB實驗組的細胞增殖能力與HSFB對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（Z=-0.218，P>0.05）。表明機械張力可刺激成纖維細胞增殖，機械張力加載5 d時，NSFB實驗組與HSFB對照組的細胞增殖能力相同。見表2。

2.2 不同加力時間對P130Cas、Integrin-β1基因及蛋白表達的影響

不同加力時間對P130Cas、Integrin-β1基因表達影響的重復測量方差分析結果顯示，Integrin-β1基因的F時間=381.543，P130Cas基因的F時間=49.641，P<0.01；Integrin-β1基因的F組間=305.988，P130Cas基因的F組間=150.636，P<0.01；表明不同組別兩基因表達隨時間的變化而不同。Integrin-β1的F交互=164.820，P130Cas的F交互=45.897，P<0.01，表明不同組別之間差異有顯著意義。張力加載3 d時，NSFB實驗組與NSFB對照組對比，P130Cas、Integrin-β1基因表達水平顯著提高，與HSFB對照組相比較，P130Cas、Integrin-β1基因表達水平降低，差異均有統(tǒng)計學意義（F=54.387～872.148，P<0.05）。張力加載5 d時，對比基因P130Cas、Integrin-β1表達水平，NSFB實驗組與HSFB對照組相近，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。張力加載7 d時，NSFB實驗組P130Cas、Integrin-β1基因表達顯著高于HSFB對照組，但顯著低于HSFB實驗組（F=34.182～82.195，P<0.05）。表明機械張力可提高NSFB和HSFB的P130Cas、Integrin-β1基因表達水平，為使NSFB的P130Cas、Integrin-β1基因表達水平與HSFB最為接近，張力加載5 d時最為適宜。見表2。不同加力時間對P130Cas、Integrin-β1蛋白表達的影響，見圖1。

3 討論

機械張力能導致成纖維細胞發(fā)生生化特征變化[7]，是導致瘢痕形成的重要因素[8]。創(chuàng)面張力影響皮膚傷口愈合與瘢痕形成，張力大小和作用時間決定其轉歸[9]。皮膚成纖維細胞是感受機械張力的效應細胞，在機械張力導致瘢痕形成的力學傳導過程中發(fā)揮重要作用[10]。不同大小、作用時間的機械張力可使皮膚成纖維細胞發(fā)生不同的生物學功能轉變[5]。所以，研究機械張力導致瘢痕形成的機制，必須首先明確皮膚成纖維細胞向HSFB轉化所需的機械張力參數(shù)。研究已證明，導致皮膚成纖維細胞產(chǎn)生機械傳導效應的機械張力最適幅度為10%[5]。但是，目前尚無實驗證明加載不同時間的機械張力是否導致成纖維細胞力學傳導效應的不同，且成纖維細胞何時表現(xiàn)與HSFB相同的力學傳導效應尚無定論。本實驗以10%的最適機械張力加載幅度為前提，擬探究使NSFB產(chǎn)生與HSFB相同的機械傳導效應的最佳時間，從而為研究機械張力導致增生性瘢痕形成的機制提供有力的實驗基礎。

本研究結果顯示，機械張力對NSFB和HSFB內整合素和P130cas表達水平的促進作用與加載時間成正比；通過對比細胞內整合素和P130cas表達水平，顯示加力的NSFB在第5天時已達到未加力的HSFB的對應參數(shù)，證明在加力5 d時，NSFB具有與HSFB相同的機械傳導能力。整合素信號通路參與的機械張力在細胞內傳導的主要機制為：只有當合適的機械張力作用于成纖維細胞時，整合素才能感受到細胞外張力[11]；細胞膜上整合素通過細胞內黏著斑與細胞骨架蛋白P130cas相連[12-14]，細胞骨架將機械信號傳導至細胞核，引起細胞內生化特征的改變[15-16]。整合素、P130cas是機械信號傳導的重要媒介，整合素將細胞表面的機械張力傳導至細胞骨架，P130cas將細胞骨架的機械信號傳導至細胞核[17]，二者相互協(xié)調，使細胞發(fā)揮有效的機械傳導效應[18-19]，是保證力學信號向化學信號轉變的重要前提。

還有研究表明，機械張力能夠刺激皮膚成纖維細胞增殖[20]，并表達HSFB的特征性因子，如α-平滑肌肌動蛋白[21]，這表明了整合素、P130cas參與的機械張力作用途徑可能在NSFB向HSFB轉化中具有重要意義。本文研究結果證明了在加力第5天時，NSFB的細胞增殖水平與未加力的HSFB相同，表明了在加力第5天時，NSFB可能有與HSFB表型趨于一致的傾向，該結果為研究機械張力導致成纖維細胞的轉化過程提供前期基礎。

綜上所述，拉伸幅度10%的機械張力加載5 d時，NSFB具有與HSFB一致的機械傳導能力。同時，本實驗證明了加力5 d時的NSFB具有與未加力的HSFB相似的細胞表型，但二者的相似程度仍需通過其他相關參數(shù)指標對比實驗進行探究。本文研究結果豐富了對皮膚成纖維細胞加力的優(yōu)化參數(shù)，將有助于建立機械張力導致的HSFB模型，為研究機械張力與瘢痕形成的關系提供了前提基礎。但成纖維細胞將張力信號轉化為生化信號的機制仍需實驗研究，機械張力對皮膚成纖維細胞向增生性HSFB轉化過程的具體機制也需進一步研究。

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