TMEM16A與肺動脈高壓大鼠肺血管重構(gòu)和增殖關(guān)系

[摘要] 目的 探討肺動脈高壓（PAH）大鼠肺血管重構(gòu)、增殖與TMEM16A蛋白表達的關(guān)系。方法 將30只8周齡雄性SD大鼠隨機分為對照組、模型2周組和模型4周組，每組各10只。對照組單次腹腔注射體積分數(shù)為0.01的DMSO溶劑，模型組單次腹腔注射野百合堿50 mg/kg。應(yīng)用小動物超聲系統(tǒng)測定各組的肺加速時間（PAT）、射血時間（ET）、PAT/ET間接評估肺動脈壓力，測定3組大鼠的右心室肥厚指數(shù)（RVHI），蘇木精-伊紅染色檢測肺血管重塑等病理學(xué)指標(biāo)，采用Western blot方法檢測TMEM16A和PCNA蛋白的相對表達量，免疫熒光化學(xué)法檢測各組肺血管平滑肌組織TMEM16A的表達。結(jié)果 模型4周組PAT/ET較對照組明顯降低（F=20.98，t=5.76，P<0.05）。對照組、模型2周組和模型4周組RVHI、血管橫截面管壁面積與血管面積比值（WA%）和肺小動脈管壁厚度占血管直徑的百分比（WT%）逐漸增高，且3組間RVHI、WT%、WA%比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F=166.60～234.26，t=4.37～21.03，P<0.05）。3組間TMEM16A和PCNA蛋白表達比較差異均有顯著性（F=286.00、427.03，t=7.50～26.00，P<0.05）。對照組、模型2周組、模型4周組肺血管平滑肌組織TMEM16A的表達逐漸增加。3組的TMEM16A與WA%、PCNA，PCNA與WA%之間均呈正相關(guān)（r=0.901～0.969，P<0.05）。結(jié)論 TMEM16A表達水平均隨造模時間延長而升高。TMEM16A表達與野百合堿誘導(dǎo)的PAH大鼠肺血管重構(gòu)與增殖呈正相關(guān)，提示TMEM16A可能是PAH疾病進展中的重要蛋白。

[關(guān)鍵詞] 高血壓，肺性；TMEM16A；肺動脈；血管重塑；細胞增殖

[中圖分類號] R544.16

[文獻標(biāo)志碼] A

[文章編號] 2096-5532（2018）03-0296-06

肺動脈高壓（PAH）是由多種原因引起的以肺動脈壓力和肺血管阻力進行性升高為特點的臨床綜合征，最終導(dǎo)致病人右心衰竭而死亡[1]。該疾病特征為肺血管收縮，肺動脈內(nèi)膜增生，平滑肌細胞增殖、肥大，原位血栓形成，進而導(dǎo)致肺動脈壁增厚、管腔狹窄，增加肺動脈壓力。盡管在過去10多年里對PAH的治療有了明顯的進步，但是其預(yù)后仍然很差，目前尚無治愈手段。已知多種原因可引起肺動脈平滑肌細胞（PASMC）胞漿內(nèi)游離鈣離子濃度升高、PASMC增殖增加，進而引發(fā)肺動脈收縮和慢性肺動脈結(jié)構(gòu)重建，最終形成PAH[2]。肺動脈收縮以及PASMC增殖是PAH形成的兩個重要環(huán)節(jié)[3]。2008年，3個研究團隊同時發(fā)現(xiàn)，TMEM16A跨膜蛋白為鈣激活氯離子通道（CaCC）的分子基礎(chǔ)蛋白[4-6]，而CaCC對于維持血管平滑肌細胞膜內(nèi)外氯離子和鈣離子濃度穩(wěn)態(tài)、調(diào)節(jié)血管張力起著至關(guān)重要的作用。且體外實驗均表明，下調(diào)TMEM16A表達可使CaCC功能受抑，減少血管收縮[4]，而血管收縮為PAH病理基礎(chǔ)。本研究旨在探討TMEM16A表達與PAH血管重構(gòu)及增殖相關(guān)性，從而為PAH的診治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

健康8周齡雄性SD大鼠30只（購于青島大學(xué)實驗動物中心），體質(zhì)量（200±10）g。野百合堿（美國Sigma公司），一抗羊抗兔TMEM16A（英國abcam公司），二抗羊抗兔TMEM16A（美國CST公司），二抗羊抗鼠TMEM16A和DAPI（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），熒光二抗羊抗鼠和羊抗兔TMEM16A（上海翊圣生物科技有限公司），BCA蛋白定量試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）

1.2 動物分組及模型的建立

將30只大鼠隨機分為對照組（A組）、模型2周組（B組）和模型4周組（C組），每組10只。在自由進食飲水、12 h晝夜循環(huán)光照條件下，大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。然后模型組大鼠均一次性腹腔注射野百合堿50 mg/kg，對照組大鼠腹腔注射同等劑量的體積分數(shù)為0.01的DMSO溶劑。

1.3 大鼠一般情況觀察

密切觀察3組大鼠在整個實驗過程中的飲食量、活動量，是否出現(xiàn)呼吸困難以及死亡等情況。

1.4 超聲心動圖檢測

大鼠稱質(zhì)量后，予以100 g/L水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉。將大鼠固定于小動物超聲系統(tǒng)操作臺上，于胸骨旁主動脈瓣水平記錄肺血流脈沖多普勒，取樣容積位于肺動脈瓣近端（5 mm）處，對準(zhǔn)最大化層流測量肺加速時間（PAT）和射血時間（ET），并計算PAT/ET。PAT是脈沖多普勒記錄從肺動脈開始流入到達峰值速度的時間間隔，ET為脈沖收縮期血流開始到結(jié)束的時間間隔。采用PAT、ET、PAT/ET間接評估大鼠肺動脈壓力。

1.5 右心室肥厚指數(shù)（RVHI）測定

A組與C組大鼠于造模后4周取材，B組于造模后2周取材。于相應(yīng)時間點處死大鼠后，迅速剖開胸腔取出大鼠的心肺組織，置于PBS溶液中，沿房室交界處去除左右心房以及大血管，分離右心室（RV）、左心室（LV）和室間隔（S），濾紙吸干多余血液及水分，使用分析天平分別稱質(zhì)量，計算RVHI。RVHI=RV/（LV+S）。

1.6 肺組織標(biāo)本制作

取右肺上葉組織，橫切，放入預(yù)先配制的40 g/L多聚甲醛中，固定48 h，蔗糖脫水，OCT包埋，切10 μm厚的薄片，貼于載玻片上，用于蘇木精-伊紅（HE）以及免疫熒光染色。取左肺組織，放入盛有PBS液的平皿中，清洗殘余血液；在體視顯微鏡下用眼科鑷取出肺細小動脈，并將動脈外脂肪及纖維結(jié)締組織剝離干凈；用眼科剪沿動脈將其剪開，將動脈內(nèi)膜朝上用無菌棉簽擦4～6次，盡量將內(nèi)膜內(nèi)皮細胞除盡。將分離好的肺小動脈置于液氮中保存，用于Western blot檢測。

1.7 HE染色檢測肺血管重構(gòu)

組織切片按常規(guī)行HE染色，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。在HE染色片上隨機選取10個視野測定50～150 μm的肺小動脈，采用Image-ProPlus圖像分析系統(tǒng)計算血管橫截面管壁面積與血管面積比值（WA%）、肺小動脈管壁厚度占血管直徑的百分比（WT%）。

1.8 Western blot分別檢測TMEM16A和PCNA蛋白表達

取保存于液氮中的肺動脈常規(guī)提取組織蛋白，用BCA法測定蛋白濃度，計算上樣量后，70 ℃煮蛋白10 min，電泳1.5 h，轉(zhuǎn)膜1.5 h，TBST洗3次、每次5 min，封閉2 h，加一抗4 ℃孵育過夜，洗膜后加二抗室溫孵育2 h，倒掉二抗溶液，進行ECL顯色。

1.9 免疫熒光化學(xué)法檢測各組肺血管平滑肌組織TMEM16A表達組織切片用PBS洗3次、每次3 min，使用動物非免疫血清封閉1 h，PBS洗3次、每次3 min，加入TMEM16A和平滑肌肌動蛋白（SMA）一抗4 ℃過夜16 h，PBS洗3次、每次3 min，加熒光二抗室溫1 h，PBS洗3次、每次3 min，DAPI染核，封片。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，符合正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)以[AKx-D]±s表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，各指標(biāo)之間的相關(guān)性檢驗采用Pearson相關(guān)分析，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

對照組大鼠在整個實驗過程中活動正常，體質(zhì)量正常增加，呼吸良好。模型組大鼠在給藥2周后，逐漸出現(xiàn)進食減少、活動量減低、毛發(fā)稀疏干枯、體質(zhì)量增長較慢甚至減低、鼻唇發(fā)紺、呼吸困難，PAH病情逐漸加重甚至死亡。對照組無大鼠死亡，模型2周組死亡1只，模型4周組死亡3只。

2.2 各組大鼠肺動脈壓力指標(biāo)比較

對照組、模型2周組和模型4周組大鼠PAT、ET、PAT/ET均逐漸減小，3組間PAT比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F=97.26，t=2.24～13.09，P<0.05）。模型4周組ET與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=5.49，t=3.30，P<0.05）；模型2周組與對照組比較，模型4周組與模型2周組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。模型4周組PAT/ET與對照組和模型2周組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=20.98，t=5.76、5.47，P<0.05）；模型2周組與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表1、圖1。

2.3 各組大鼠RVHI比較

對照組、模型2周組和模型4周組大鼠RVHI分別為0.26±0.01、0.34±0.04和0.55±0.03，3組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F=166.60，t=4.37～17.54，P<0.05）。

2.4 各組大鼠肺血管重構(gòu)病理學(xué)觀察

對照組大鼠血管內(nèi)壁光滑，血管平滑肌未出現(xiàn)增生肥大現(xiàn)象；而模型組大鼠隨著造模時間延長，可以觀察到血管平滑肌細胞增生、肥大，管腔狹窄閉塞，模型4周組血管閉塞程度較模型2周組嚴(yán)重。3組大鼠肺動脈WA%和WT%比較差異均有顯著性（F=189.51、234.26，t=6.16～21.03，P<0.05）。見表2、圖2。

2.5 各組大鼠TMEM16A和PCNA蛋白表達比較

對照組、模型2周組和模型4周組大鼠肺動脈組織TMEM16A和PCNA蛋白表達逐漸增加，3組間TMEM16A和PCNA蛋白表達比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F=286.00、427.03，t=7.50～26.00，P<0.05）。見表3。

2.6 各組肺血管平滑肌組織TMEM16A表達比較

對照組、模型2周組、模型4周組大鼠肺血管平滑肌組織TMEM16A的表達逐漸增加。見圖3。

2.7 相關(guān)性分析

各組肺動脈組織TMEM16A與WA%、PCNA表達，以及PCNA與WA%表達之間均呈顯著正相關(guān)（r=0.901～0.969，P<0.05）。

3 討論

野百合堿可引起肺動脈血管內(nèi)皮受損進而誘導(dǎo)肺血管重構(gòu)，野百合堿造模為一種操作簡便、在國內(nèi)外應(yīng)用較為廣泛的誘導(dǎo)大鼠PAH動物模型的方法[7-8]?；|(zhì)重構(gòu)、膠原蛋白沉積、血管細胞增殖和遷移、肺動脈持續(xù)收縮可引起血管重構(gòu)，進而發(fā)生PAH。通過小動物超聲系統(tǒng)檢測PAT、ET可用于評估PAH造模是否成功，PAH形成時，PAT以及PAT/ET降低[9-11]，該方法目前已被多研究中心證實，故本實驗采用該方法檢測PAH造模情況。本研究結(jié)果顯示，大鼠注射野百合堿2周后，肺動脈重構(gòu)及RVHI增加，PAT變短；注射野百合堿4周后，PAT、ET及PAT/ET均明顯降低，肺小動脈重構(gòu)以及RVHI均明顯增加，提示肺動脈壓力明顯升高，完全形成PAH。

CaCC在多種生理進程中扮演著重要作用，細胞內(nèi)鈣離子濃度增加可引起CaCC開放，氯離子外流，致使膜除極[12]，進一步激活電壓依賴性鈣通道，大量鈣離子進入細胞內(nèi)，引起血管的收縮[13-14]。而TMEM16A跨膜蛋白作為CaCC蛋白的分子基礎(chǔ)蛋白，目前已發(fā)現(xiàn)其廣泛表達于多種組織的平滑肌細胞，如氣管、肺動脈、視網(wǎng)膜微動脈、主動脈、頸動脈、門靜脈、腸系膜動脈等，其中表達于血管平滑肌的TMEM16A參與調(diào)控血管舒縮功能[15-17]。

有研究表明，在低氧狀態(tài)下，大鼠PASMC的TMEM16A表達上調(diào)[18]。血管內(nèi)壓引起動脈平滑肌非選擇性離子通道活化，引起細胞內(nèi)鈣離子增加，激活TMEM16A通道，引起動脈平滑肌細胞除極和血管收縮[19]。下調(diào)TMEM16A表達，可以減低鈣激活性氯離子電流[20]，減弱血管張力[21]。王炳香等[17]研究顯示，在自發(fā)性高血壓模型主動脈、頸動脈、腸系膜下動脈中TMEM16A的表達與對照組相比增高，敲除TMEM16A或下調(diào)TMEM16A通道活性，均可降低血壓[17]。但也有研究顯示，在腎性高血壓模型中，隨高血壓病情進展，TMEM16A的表達量逐漸降低；下調(diào)TMEM16A的表達，可引起血管緊張素誘導(dǎo)的CyclinD1、CyclinE、PCNA的表達增加[22]。因此，研究TMEM16A表達與肺血管重構(gòu)以及增殖的關(guān)系，對于診斷和治療PAH具有十分重要的意義。

PCNA為檢測細胞增殖的重要指標(biāo)，是DNA聚合酶δ的輔助蛋白，為DNA復(fù)制合成必不可少的因子，其水平與細胞增長率呈正比[17]。本文研究結(jié)果顯示，模型組大鼠肺小動脈平滑肌組織PCNA表達上調(diào)，并隨病情進展維持高水平，且PCNA與WA%呈正相關(guān)，證明了造模使PCNA表達增加，血管平滑肌增殖在PAH發(fā)病中起重要作用。

FORREST等[7]研究結(jié)果顯示，在野百合堿誘導(dǎo)的大鼠PAH模型中，PASMC的TMEM16A表達增加。本文研究結(jié)果也顯示，大鼠肺動脈平滑肌組織TMEM16A的表達在造模2周后升高并維持，且TMEM16A表達與WA%呈正相關(guān)，進一步證實TMEM16A在PAH的血管重構(gòu)中起重要作用。相關(guān)分析顯示，TMEM16A與PCNA表達呈正相關(guān)，這與在高血壓模型中使用T16Ainh-A01阻斷ANO1通道活性后PCNA表達降低[17]的結(jié)論一致。本研究結(jié)果表明，TMEM16A蛋白與PAH中肺血管重構(gòu)以及平滑肌增殖呈正相關(guān)，且TMEM16A表達隨PAH疾病進展逐漸增高并維持在高水平，這與腎性高血壓模型中TMEM16A表達逐漸降低[22]的結(jié)論相反，可能與所造動物模型及TMEM16A表達部位不同而產(chǎn)生不同的生物學(xué)機制有關(guān)。

先前的研究結(jié)果已提示，TMEM16A可能為PAH進展中重要的分子蛋白。但對于TMEM16A在PAH進展中引起血管重構(gòu)、血管平滑肌細胞增殖的上下游的調(diào)控機制仍不清楚，需進一步研究。本文結(jié)果為研究TMEM16A的分子生物學(xué)機制以及電生理機制奠定了基礎(chǔ)，為臨床診斷、治療PAH等血管疾病提供了有效靶點。

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