赤霉素對(duì)精子運(yùn)動(dòng)力和細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制

[摘要] 目的 探討赤霉素對(duì)精子運(yùn)動(dòng)力和細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制。方法 采用Percoll梯度離心法提取有正常生理功能的人精子作為正常精子模型，提取的優(yōu)質(zhì)精子培養(yǎng)于含不同濃度赤霉素的G-IVF PLUS培養(yǎng)液中，采用精子質(zhì)量分析儀檢測(cè)精子運(yùn)動(dòng)力；流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)精子細(xì)胞活性氧（ROS）水平及凋亡情況；免疫熒光技術(shù)檢測(cè)氧化應(yīng)激、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)量；ATP酶檢測(cè)試劑盒檢測(cè)Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性。結(jié)果 精子運(yùn)動(dòng)力隨赤霉素濃度的增加、時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低；處理組精子細(xì)胞ROS水平明顯高于對(duì)照組（F=21.40，P<0.05），過氧化物歧化酶（SOD）蛋白水平較對(duì)照組明顯降低（F=28.13，P<0.05）；凋亡蛋白P53、BAX表達(dá)水平較對(duì)照組明顯升高（F=104.54、59.29，P<0.05）；Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性較對(duì)照組明顯降低（F=24.48、18.81，P<0.05）。結(jié)論 赤霉素可通過氧化應(yīng)激反應(yīng)降低精子運(yùn)動(dòng)力，促進(jìn)精子細(xì)胞凋亡。

[關(guān)鍵詞] 赤霉素類；精子能動(dòng)性；氧化性應(yīng)激；細(xì)胞凋亡；腺苷三磷酸酶類

[中圖分類號(hào)] R978.15；R321.1

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A

[文章編號(hào)] 2096-5532（2018）03-0282-05

赤霉素屬于四環(huán)雙萜類植物激素，具有一個(gè)赤霉烷環(huán)骨架，在植株生長(zhǎng)過程中具有促進(jìn)細(xì)胞分裂的作用，目前廣泛應(yīng)用于反季節(jié)水果的種植。赤霉素在成熟的瓜果蔬菜中殘留量較低，在烹飪過程中也會(huì)遭到不同程度的破壞，所以其毒性一般定義為低毒或微毒。但是，一些種植者為了提高經(jīng)濟(jì)效益，在生產(chǎn)中過度依賴赤霉素。而高劑量使用赤霉素可能會(huì)導(dǎo)致食品、環(huán)境中的高殘留，危及食品安全，對(duì)人類健康產(chǎn)生潛在危害。國(guó)內(nèi)外研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，赤霉素對(duì)大鼠具有神經(jīng)毒性[1]；并可導(dǎo)致大鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)破壞[2]，而且其肝臟毒性還可通過孕鼠遺傳到下一代[3]；甚至長(zhǎng)期赤霉素?cái)z入可誘發(fā)腫瘤的形成[4-5]。同時(shí)也有研究顯示，赤霉素可損害雄性生殖系統(tǒng)健康，妨礙精子生成，降低精子存活率[6]，通過破壞精子DNA雙鏈結(jié)構(gòu)，降低精子核成熟度[7]，并可誘導(dǎo)大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激，降低抗氧化防御功能[8]；赤霉素還可通過干擾睪丸類固醇激素的分泌，影響精子的發(fā)生[9]。至今關(guān)于赤霉素對(duì)雄性生殖系統(tǒng)的毒性作用，都基于動(dòng)物模型進(jìn)行研究，而赤霉素對(duì)人精子運(yùn)動(dòng)力的影響及其機(jī)制的探究尚未見報(bào)道。雖然國(guó)際上對(duì)赤霉素的殘留限量標(biāo)準(zhǔn)越來越嚴(yán)格，而我國(guó)目前還未出臺(tái)相應(yīng)的使用限量標(biāo)準(zhǔn)。因此，本研究以人精子為研究對(duì)象，在精子培養(yǎng)液中加入不同濃度赤霉素，觀察赤霉素對(duì)人精子運(yùn)動(dòng)力和細(xì)胞凋亡的影響，初步探討其作用機(jī)制，旨在引起人們對(duì)于赤霉素毒害作用的廣泛重視，最大限度降低赤霉素對(duì)于人類健康的危害。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 儀器與試劑 SCA精子質(zhì)量分析儀購(gòu)自西班牙Microptic公司；恒溫箱購(gòu)自北京福意聯(lián)公司；流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD Bioscience公司；激光共聚焦顯微鏡購(gòu)自德國(guó)徠卡儀器有限公司；紫外線分光光度計(jì)購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司，G-IVFTM培養(yǎng)液購(gòu)自北京生東科技有限公司。活性氧檢測(cè)試劑盒、牛血清清蛋白（BSA）以及ATP酶檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自青島西康生物技術(shù)有限公司。Triton X-100、Hoechst33342、BCA、Annexin-V-FITC試劑盒均購(gòu)自上海索寶生物科技有限公司。

1.1.2 藥物 赤霉素（購(gòu)自青島西康生物技術(shù)有限公司），相對(duì)分子質(zhì)量為346.374，充分溶解于無水乙醇，培養(yǎng)液中最終含體積分?jǐn)?shù)為0.005的乙醇，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.1.3 精液樣品采集 精液樣本來源于我院生殖中心男科門診就診的男性，從中篩選出50份活力正常精子的精液作為標(biāo)本。受試者年齡在25～47歲，平均年齡（30.32±3.21）歲，排除性傳播疾?。ò滩?、梅毒、乙型肝炎或生殖道感染疾?。┘靶?、腎等系統(tǒng)嚴(yán)重疾病的受試者。受試者禁欲3～7 d，手淫法取精液，將精液置于37 ℃恒溫箱中30 min。精液充分液化后，按照第5版《世界衛(wèi)生組織精液分析指南（WHO，2010）》進(jìn)行精液常規(guī)檢查：精液體積>1.5 mL，精子密度>15×109/L，精子活動(dòng)率（PR+NP）>40%（NP為非前向運(yùn)動(dòng)精子），精子前向運(yùn)動(dòng)（PR）>32%，存活率>58%。選擇以上指標(biāo)均正常的精液為樣本，為了避免個(gè)體差異對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，將所有達(dá)標(biāo)精液混合于50 mL的EP管中，混合充分。然后，取2 mL精液加入1 mL的Percoll密度梯度（45%～90%）離心液中離心（2 000 r/min，10 min），分離出優(yōu)質(zhì)精子，并懸浮于G-IVFTM培養(yǎng)液中，調(diào)節(jié)精子密度為10×109/L。每位受試者均簽署了知情同意書，該研究方法已得到青島市婦女兒童醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 研究方法

1.2.1 赤霉素處理精子 將上述懸浮處理的精液樣本分為6組，每組3個(gè)重復(fù)樣本。A組：培養(yǎng)液中加入終體積分?jǐn)?shù)為0.005的乙醇；B組：培養(yǎng)液中未加赤霉素和乙醇；C組、D組、E組、F組的培養(yǎng)液中赤霉素最終濃度分別為1、2、4、8 mmol/L。

1.2.2 精子運(yùn)動(dòng)能力評(píng)價(jià) 分別于培養(yǎng)0、1、5、9、19 h應(yīng)用精子運(yùn)動(dòng)分析儀采用CASA軟件檢測(cè)精子運(yùn)動(dòng)力。根據(jù)WHO（1999）的標(biāo)準(zhǔn)可以把精子的活力分成a、b、c、d等4個(gè)級(jí)別：a級(jí)代表能夠快速向前呈直線運(yùn)動(dòng)的精子；b級(jí)代表活動(dòng)尚可，能夠向前直線運(yùn)動(dòng)的精子；c級(jí)代表只能曲線運(yùn)動(dòng)的精子；d級(jí)代表不能做任何向前運(yùn)動(dòng)，只在原地蠕動(dòng)的精子。臨床上一般以（a+b）%作為檢測(cè)精子活動(dòng)力大小的指標(biāo)。

1.2.3 Annexin-V-FITC試劑盒檢測(cè)精子凋亡 細(xì)胞凋亡早期，膜磷脂酰絲氨酸（PS）由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)，Annexin V是一種磷脂結(jié)合蛋白，與PS有高度親和力，故可通過細(xì)胞外側(cè)暴露的PS與凋亡早期細(xì)胞的胞膜結(jié)合。赤霉素處理后，用預(yù)冷的PBS洗滌2次并離心（1 500 r/min，3 min），采用1×Annexin V結(jié)合緩沖液100 μL懸浮，然后分別加入Annexin V和PI各 5 μL，室溫避光孵育15 min，在30 min內(nèi)用流式細(xì)胞儀對(duì)精子細(xì)胞進(jìn)行凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.2.4 活性氧（ROS）的測(cè)定 應(yīng)用ROS檢測(cè)試劑盒DCFH-DA法測(cè)定ROS水平。赤霉素處理后，PBS洗滌3次并離心（1 500 r/min，3 min），懸浮于稀釋好的DCFH-DA中，細(xì)胞密度為（0.1～2.0）×1010/L，37 ℃避光反應(yīng)30 min，用流式細(xì)胞儀測(cè)定波長(zhǎng)530 nm處的ROS含量。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.2.5 免疫熒光技術(shù)檢測(cè)氧化應(yīng)激、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)量 赤霉素處理后的精液樣品用PBS洗滌3次并離心（1 500 r/min，3 min），棄上清，用40 g/L的多聚甲醛固定至少1 h，然后將固定好的精子細(xì)胞均勻涂抹于載玻片上，自然晾干；PBS浸洗玻片3次，每次5 min；20 g/L的Triton X-100（PBS配制）室溫通透30 min，PBS浸洗玻片3次，每次5 min，吸水紙吸干PBS，在玻片上滴加100 g/L的BSA，室溫封閉30 min；吸水紙吸掉封閉液，每張玻片滴加足夠量的一抗（1∶100）并放入濕盒，37 ℃避光孵育2 h；用10 g/L的 BSA洗滌3次，每次5 min，吸水紙吸干爬片上多余液體后滴加熒光二抗（1∶150），濕盒中37 ℃避光孵育1 h；PBS洗滌玻片3次，每次5 min，滴加Hoechst33342 置37 ℃避光孵育5 min；PBST洗滌玻片3次，每次5 min，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后在徠卡激光共聚焦顯微鏡下觀察采集圖像。陰性對(duì)照組只加二抗，不加一抗。

1.2.6 Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性檢測(cè)

使用ATP酶檢測(cè)試劑盒檢測(cè)Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性。赤霉素處理精子后，PBS洗滌3次并離心（2 000 r/min，10 min），加入生理鹽水冰上裂解細(xì)胞30 min，離心（12 000 r/min，5 min）取上清后，按照試劑盒說明書測(cè)定酶活性，應(yīng)用紫外線分光光度計(jì)檢測(cè)660 nm波長(zhǎng)處的光密度（OD）值，同時(shí)使用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度。按照說明書中公式，計(jì)算ATP酶活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以[AKx-D]±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 赤霉素對(duì)體外精子運(yùn)動(dòng)能力的影響

為了確定使精子運(yùn)動(dòng)力發(fā)生變化的最佳濃度及時(shí)間，于不同時(shí)間采用CASA系統(tǒng)檢測(cè)了不同赤霉素濃度處理后的（a+b）%級(jí)精子。結(jié)果表明，A組和B組在不同時(shí)間（a+b）%級(jí)精子無明顯差異，排除了乙醇對(duì)精子的影響。在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中均以A組為對(duì)照組。隨著赤霉素濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，（a+b）%級(jí)精子數(shù)量逐漸降低；在赤霉素暴露的19 h中，于1 h的（a+b）%級(jí)精子降低最為迅速，表明赤霉素對(duì)精子有急性毒性作用，因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選定1 h為赤霉素最佳處理時(shí)間。在赤霉素處理1 h時(shí)， C組（a+b）%級(jí)精子與A組無明顯差異（t=2.109，P>0.05），E、F組與A組比較均具有明顯差異（F=8.922，P<0.05），因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選定D、E組為赤霉素最佳處理濃度。見表1。

2.2 赤霉素對(duì)人精子氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響

赤霉素處理1 h后，應(yīng)用ROS檢測(cè)試劑盒和流式細(xì)胞儀檢測(cè)ROS水平，結(jié)果顯示，D、E組相對(duì)熒光強(qiáng)度（91.93±0.57、94.64±0.98）明顯高于A組（89.79±1.10），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=21.40，P<0.05），說明赤霉素處理可導(dǎo)致精子ROS水平增加；同時(shí)，采用免疫熒光法檢測(cè)氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白SOD、過氧化氫酶（CAT）含量，結(jié)果顯示，D、E組SOD相對(duì)熒光強(qiáng)度較A組明顯降低（F=28.13，P<0.05），D、E組CAT相對(duì)熒光強(qiáng)度較A組明顯升高（F=27.96，P<0.05）。

2.3 赤霉素對(duì)人精子細(xì)胞凋亡的影響

赤霉素處理1 h后，應(yīng)用Annexin-V-FITC試劑盒和流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組精子細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果提示，D、E組凋亡細(xì)胞百分率（（6.43±4.59）%、（8.70±4.03）%）均較A組（（4.33±2.32）%）明顯增高，兩組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=16.45，P<0.05）。同時(shí)，采用免疫熒光法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白P53和BAX含量，結(jié)果顯示，D、E組凋亡相關(guān)蛋白P53相對(duì)熒光強(qiáng)度明顯高于A組（F=104.54，P<0.05），E組凋亡相關(guān)蛋白BAX相對(duì)熒光強(qiáng)度明顯高于A組（F=59.29，P<0.05），D組與A組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.4 赤霉素對(duì)人精子細(xì)胞中ATP酶活性的影響

赤霉素處理1 h后，應(yīng)用ATP酶活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性，結(jié)果顯示，D組和E組Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶的活性均明顯低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=24.48、18.81，P<0.05）。見表2。

3 討論

近些年，精液質(zhì)量在全球范圍內(nèi)有明顯下降趨勢(shì)[10-11]。WANG等[12]研究了2008—2014年中國(guó)精子庫(kù)中5 210名捐精者的精液質(zhì)量，發(fā)現(xiàn)精液質(zhì)量參數(shù)中精液體積、精子活力、精液濃度和精子總數(shù)在7年間明顯下降。精子質(zhì)量的下降除了與病原菌感染、藥物濫用、不良的生活方式有關(guān)外，與環(huán)境化學(xué)物質(zhì)污染也有密切關(guān)系[13-15]。赤霉素是我國(guó)農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)中常用的一種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，廣泛應(yīng)用于反季節(jié)瓜果蔬菜的生產(chǎn)中，人們可以通過多種途徑攝入或接觸。多項(xiàng)研究證實(shí)，赤霉素具有肝毒性、腎毒性、遺傳毒性、神經(jīng)毒性，甚至可致癌和致畸。因此，有必要讓人們了解赤霉素對(duì)人類生殖系統(tǒng)的危害作用，有意識(shí)地避免赤霉素直接或間接攝入。本課題以人精子為研究對(duì)象，以（a+b）%級(jí)精子為指標(biāo)，觀察不同濃度赤霉素對(duì)體外培養(yǎng)精子的運(yùn)動(dòng)力及細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果表明，赤霉素暴露可降低精子運(yùn)動(dòng)能力，增加精子細(xì)胞凋亡。

然而，赤霉素對(duì)精子運(yùn)動(dòng)力影響的作用機(jī)制有待探討。在早期的動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)中，赤霉素可誘導(dǎo)大鼠肝臟氧化應(yīng)激發(fā)生，肝細(xì)胞空泡化，細(xì)胞核皺縮，同時(shí)伴有凋亡蛋白Bcl-2的過度表達(dá)[2]；赤霉素還可誘導(dǎo)大鼠腎臟氧化應(yīng)激發(fā)生，脂質(zhì)過氧化指標(biāo)丙二醛顯著增加，抗氧化酶CAT和SOD明顯降低，同時(shí)伴有腎臟組織結(jié)構(gòu)的破壞[16]。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，赤霉素可能通過氧化應(yīng)激反應(yīng)破壞機(jī)體組織結(jié)構(gòu)及其功能。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果與之相一致，即一定濃度的赤霉素暴露使精子細(xì)胞ROS生成明顯增加，而人精子對(duì)ROS更加敏感[17]，從而導(dǎo)致精子運(yùn)動(dòng)力降低。精子細(xì)胞中適量的ROS可調(diào)節(jié)精子獲能和頂體反應(yīng)，并且參與精子的受精過程[18]，但ROS產(chǎn)生過多，可破壞抗氧化防御系統(tǒng)，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生。并且多項(xiàng)研究結(jié)果證實(shí)，脂質(zhì)過氧化物與精子存活率呈明顯負(fù)相關(guān)性[19-21]。SOD和CAT是機(jī)體重要的抗氧化酶，可清除體內(nèi)氧自由基，降低脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物生成，從而保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整。本研究結(jié)果顯示，抗氧化相關(guān)蛋白SOD活性明顯降低，更有力地證實(shí)氧化應(yīng)激的發(fā)生，導(dǎo)致氧化-抗氧化防御系統(tǒng)失衡。

Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶廣泛分布于動(dòng)物的細(xì)胞膜及細(xì)胞器生物膜上，可維持細(xì)胞正常的生理功能，在能量代謝、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和信息傳遞方面具有極其重要的作用。

Na+-K+-ATP酶是一種跨膜蛋白，在將細(xì)胞內(nèi)的Na+泵出細(xì)胞外同時(shí)而將細(xì)胞外的K+泵入細(xì)胞內(nèi)，維持細(xì)胞內(nèi)外正常的離子濃度差，Na+-K+-ATP酶還可催化水解ATP，為生命活動(dòng)提供能量。Ca2+-ATP酶可調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外Ca2+濃度，維持細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞正常的電生理活動(dòng)。Ca2+作為一種細(xì)胞信號(hào)第二信使，在精子運(yùn)動(dòng)的調(diào)節(jié)中起重要作用[22]。在正常生理?xiàng)l件下，親脂性化合物可以激活配體門控Ca2+通道，誘導(dǎo)Ca2+內(nèi)流，維持精子的正常運(yùn)動(dòng)和功能[23]。而機(jī)體在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)ROS的積累可破壞精子脆膜的流動(dòng)性及完整性，導(dǎo)致Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶失活。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，一定濃度的赤霉素暴露可導(dǎo)致精子Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性的降低，原因可能與自由基破壞膜蛋白密切相關(guān)。Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性降低，可使細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，從而降低精子運(yùn)動(dòng)力，增加細(xì)胞凋亡。線粒體內(nèi)Ca2+超載可損傷線粒體功能，導(dǎo)致ATP合成障礙，細(xì)胞凋亡。線粒體有氧呼吸產(chǎn)生的ATP是精子運(yùn)動(dòng)及受精過程主要的能量來源[24]，ROS可導(dǎo)致線粒體基質(zhì)腫脹、外膜破裂以及線粒體細(xì)胞色素C釋放，繼而引起精子細(xì)胞ATP耗竭和細(xì)胞凋亡[25-26]。Na+-K+-ATP酶的活性是反映精子運(yùn)動(dòng)力強(qiáng)弱的標(biāo)志之一，Na+-K+-ATP酶活性降低是導(dǎo)致少弱精子癥最重要的因素[27]。LESTARI等[28-29]研究顯示，弱精子癥組精子的Na+-K+-ATP酶活性明顯低于正常精子組，并提出Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性可作為評(píng)估精子運(yùn)動(dòng)能力的一項(xiàng)重要參數(shù)。

綜上所述，赤霉素可通過氧化應(yīng)激反應(yīng)抑制精子運(yùn)動(dòng)力，細(xì)胞中ROS蓄積過多可破壞膜蛋白，使Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性降低，導(dǎo)致精子細(xì)胞供能障礙和細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，促進(jìn)精子細(xì)胞凋亡。但是，本文對(duì)于上述機(jī)制的探討尚較淺顯，有待更深入的研究，并且ROS蓄積可導(dǎo)致精子DNA損傷[30]及精子線粒體功能障礙[31]，可從赤霉素對(duì)其他精子參數(shù)如線粒體結(jié)構(gòu)與功能、DNA雙鏈完整性方面，更加深入地研究赤霉素對(duì)男性生殖系統(tǒng)的危害。

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