NRG—1β對大鼠腦缺血再灌注損傷后造血祖細胞激酶1表達影響

[摘要] 目的 探討神經(jīng)調(diào)節(jié)素1β（NRG-1β）對大鼠腦缺血再灌注損傷后造血祖細胞激酶1（HPK1）表達的影響和意義。方法 將Wistar大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組和NRG-1β治療組。采用改良Longa法制備大鼠腦缺血2 h再灌注24 h模型。采用改良神經(jīng)功能缺損評分（mNSS評分）評價各組大鼠神經(jīng)行為功能，蘇木精-伊紅染色檢測神經(jīng)細胞病理形態(tài)，TUNEL染色檢測神經(jīng)細胞凋亡，免疫組化染色和Westem blot檢測HPK1表達水平。結(jié)果 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠mNSS評分升高，神經(jīng)細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)異常，凋亡細胞增多，HPK1蛋白表達增強；與模型組相比，NRG-1β治療組大鼠mNSS評分降低，神經(jīng)行為功能改善，神經(jīng)細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)異常減輕，凋亡細胞數(shù)降低，HPK1蛋白表達降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F=15.1～22.4，P<0.05）。結(jié)論 NRG-1β可通過抑制腦缺血再灌注后HPK1的表達抗細胞凋亡，發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

[關(guān)鍵詞] 神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1；腦缺血；再灌注損傷；造血祖細胞激酶1

[中圖分類號] R977.6；R364.1

[文獻標(biāo)志碼] A

[文章編號] 2096-5532（2018）03-0273-04

神經(jīng)調(diào)節(jié)素1β（NRG-1β）是參與神經(jīng)元存活和功能修復(fù)的生長因子家族成員之一，是一種由神經(jīng)膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元產(chǎn)生的細胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白[1-2]，與酪氨酸激酶家族的ErbB受體結(jié)合，通過影響神經(jīng)細胞的發(fā)育、增殖分化、髓鞘及突觸形成，抑制腦缺血造成的皮質(zhì)損傷、神經(jīng)元凋亡、膠質(zhì)反應(yīng)、炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)細胞因子表達，發(fā)揮神經(jīng)保護作用[3]。本課題組前期研究結(jié)果表明，在腦缺血再灌注損傷中，NRG-1β通過JNK信號通路發(fā)揮神經(jīng)保護作用，但是其具體作用靶點尚有待驗證。造血祖細胞激酶1（HPK1）屬于哺乳動物Ste20相關(guān)蛋白激酶的MAP4K家族[4]。HPK1參與許多信號級聯(lián)反應(yīng)，包括MAPK信號、抗原受體信號、凋亡信號、生長因子信號以及細胞因子信號等[4-6]。HPK1一旦被激活，可有效激活SAPK/JNK信號通路的絲裂原活化蛋白激酶[7]。敲除HPK1基因可通過MLK3-MKK7-JNK3通路對大鼠缺血后腦組織產(chǎn)生神經(jīng)保護作用[8]。因此，本研究旨在探討NRG-1β在大鼠大腦中動脈缺血再灌注（MCAO/R）模型中的神經(jīng)保護功能，及其HPK1相關(guān)作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 成年健康雄性Wistar大鼠40只，體質(zhì)量240～270 g，SPF級，青島市藥品檢驗所實驗動物中心提供（SCXK（魯）20140010）。本動物實驗經(jīng)青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部倫理委員會批準(zhǔn)。

1.1.2 藥品和試劑 NRG-1β（RD公司）；苯甲磺酰氟（PMSF，北京索萊寶科技有限公司）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)研究所）；TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒（Roche公司）；兔抗大鼠HPK1一抗（博奧森生物公司）；HRP標(biāo)記驢抗兔二抗（Abcam公司）；兔抗大鼠β-actin抗體（武漢博士德生物公司）；二步法免疫組化試劑盒（PV-6001，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；牛血清清蛋白（BSA，Bioharp公司）。

1.2 動物分組及制備模型

實驗前將大鼠置于動物房在控制室溫、自然光照條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，大鼠自由進食、飲水。隨機取10只大鼠作為假手術(shù)組，其余30只大鼠應(yīng)用改良Longa線栓法制備MCAO/R模型。大鼠術(shù)前禁食12 h，腹腔注射100 g/L水合氯醛（300 mg/kg）麻醉，俯臥位固定，用激光多普勒血流檢測儀（PE-5001，瑞典）監(jiān)測局部腦血流量（rCBF），待血流趨于平穩(wěn)時，將線栓插入頸內(nèi)動脈，然后置入威利斯環(huán)，缺血2 h后拔除線栓實現(xiàn)再灌注[9]。以插入線栓后rCBF降到插入線栓前的30%及以下、拔除線栓后rCBF恢復(fù)至插入線栓前的80%及以上作為模型制備成功的標(biāo)準(zhǔn)。將模型制備成功的20只大鼠再隨機分為模型組和NRG-1β治療組，每組10只。術(shù)中所有大鼠體溫控制在（37.1±0.5）℃。

1.3 干預(yù)措施

假手術(shù)組不插入線栓，其余步驟同模型組。模型組應(yīng)用線栓法建立MCAO/R模型，缺血2 h后拔除線栓再灌注24 h后，斷頭取腦。NRG-1β治療組缺血2 h拔除線栓后，立即用微量注射器經(jīng)頸內(nèi)動脈給予NRG-1β（2 μg/kg，PBS溶解）5 μL，其余步驟同模型組。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 大鼠神經(jīng)功能評分 缺血2 h再灌注24 h以后，由一名不知情者采用改良神經(jīng)功能缺損評分（mNSS評分）對實驗大鼠進行神經(jīng)功能評價[10]，評分越高說明神經(jīng)功能損傷越重。

1.4.2 蘇木素-伊紅（HE）染色 每組取5只大鼠，于缺血2 h再灌注24 h后，用水合氯醛腹腔注射麻醉，經(jīng)心臟灌注生理鹽水200 mL、40 g/L多聚甲醛200 mL，斷頭取腦組織，石蠟包埋，切片。石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，行HE染色，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察。在400倍光鏡下，每張切片隨機觀察皮質(zhì)區(qū)5個不重疊的視野計數(shù)細胞，取其均值。神經(jīng)細胞損傷程度以變性細胞指數(shù)（DCI）表示，DCI=變性細胞數(shù)/細胞總數(shù)。

1.4.3 TUNEL染色 石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，抗原修復(fù)，加TUNEL反應(yīng)液1 h，全程避光操作，抗熒光猝滅劑封片。在400倍光鏡（Lwica TCS SP8）下，由不知情者在每張切片中隨機選取皮質(zhì)區(qū)5個不重疊的視野拍照。

1.4.4 免疫組化染色 石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化，微波修復(fù)，行二步法免疫組織化學(xué)染色，加入HPK1一抗（1∶500）4 ℃孵育過夜，加二抗2 h，DAB顯色，用蘇木精復(fù)染。陰性對照切片以0.01 mol/L的PBS替代一抗。

1.4.5 Western blot檢測HPK1的表達 大鼠缺血2 h再灌注24 h后，每組取5只，以水合氯醛麻醉，經(jīng)心臟灌注肝素化生理鹽水，取缺血側(cè)半球腦組織100 mg，加入細胞裂解液，冰上超聲波震蕩提取蛋白，用冷凍離心機（Eppendorf 5801，德國）在4 ℃下以12 000 r/min離心10 min，去沉淀取上清液，用BCA法測蛋白濃度。蛋白經(jīng)100 g/L的SDS-PAGE凝膠電泳，濕法轉(zhuǎn)至PVDF膜上。以50 g/L的BSA室溫封閉2 h，加入HPK1一抗（1∶1 000）4 ℃孵育過夜，加二抗（1∶5 000）室溫孵育2 h，發(fā)光顯影。應(yīng)用凝膠成像分析系統(tǒng)（Biospectrum 810 Imaging system，UVP，USA）測定各條帶的灰度值，計算目的蛋白的相對灰度值（RVP），RVP=目的蛋白灰度值/β-actin內(nèi)參灰度值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)以[AKx-D]±s表示，多組比較采用單因素設(shè)計方差分析，組間兩兩比較采用Bonferroni’s法。

2 結(jié)果

2.1 造模大鼠rCBF的變化

插入線栓后大鼠rCBF急劇下降至基礎(chǔ)值的（15.0±4.8）%，缺血2 h拔除線栓再灌注后rCBF恢復(fù)至基礎(chǔ)值的（89.6±8.2）%。

2.2 各組大鼠神經(jīng)功能評分比較

假手術(shù)組大鼠無神經(jīng)功能缺損，mNSS評分為0分。模型組大鼠表現(xiàn)出神經(jīng)系統(tǒng)行為障礙，mNSS評分（9.58±2.17）較假手術(shù)組明顯增高，NRG-1β治療組大鼠mNSS評分（7.50±1.21）較模型組明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=22.4，P<0.05）。

2.3 病理形態(tài)學(xué)觀察

假手術(shù)組大鼠腦皮質(zhì)區(qū)細胞胞體較大而圓，分布均勻，輪廓清晰，結(jié)構(gòu)完整；模型組細胞皺縮、排列紊亂，細胞間隙增大；NRG-1β治療組大鼠神經(jīng)細胞損傷較模型組減輕，細胞排列較整齊，輪廓較清晰。模型組大鼠神經(jīng)細胞DCI（0.69±0.05）較假手術(shù)組（0.14±0.04）明顯升高，NRG-1β治療組大鼠DCI（0.28±0.07）較模型組明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=19.4，P<0.05）。見圖1。

2.4 各組大鼠細胞凋亡比較

假手術(shù)組大鼠腦皮質(zhì)區(qū)存在少量凋亡細胞，模型組凋亡細胞較假手術(shù)組明顯增多，NRG-1β治療組凋亡細胞數(shù)較模型組明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=20.1，P<0.05）。見圖2。

2.5 各組大鼠神經(jīng)細胞HPK1表達的比較

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠神經(jīng)細胞HPK1蛋白表達微弱，細胞著色較淺；模型組神經(jīng)細胞深染、固縮，HPK1蛋白表達較假手術(shù)組明顯增加；NRG-1β治療組細胞染色明顯淺于模型組，HPK1蛋白表達減少。Western blot檢測結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠HPK1蛋白表達水平較低，模型組HPK1蛋白表達較假手術(shù)組明顯增加，而治療組HPK1蛋白表達較模型組明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=15.1，P<0.05）。見圖3。

3 討論

有研究表明，NRG-1β在MCAO/R模型中具有神經(jīng)保護及抗炎作用[11]。本課題組前期研究也已經(jīng)證明，NRG-1β在腦缺血再灌注損傷中通過JNK信號通路發(fā)揮神經(jīng)保護作用[12]，但是其具體作用靶點尚有待驗證。HPK1影響細胞的生長和分化[13]，在JNK信號通路中起非常關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用[14-19]。HPK1在腦缺血時順序激活MAP3K-MAP2K-JNK通路[4-5，20]，從而參與細胞凋亡。在小鼠的CD4+T細胞中，HPK1過度激活可以增加FasL的表達和JNK的活性[21]。因此，本研究探討了NRG-1β對MCAO/R大鼠發(fā)揮神經(jīng)保護功能的HPK1相關(guān)作用機制。

本文研究結(jié)果表明，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠HPK1的表達明顯增加，神經(jīng)行為功能嚴重受損，神經(jīng)細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)明顯改變，凋亡細胞數(shù)增加，而經(jīng)NRG-1β處理后，NRG-1β治療組大鼠HPK1的表達明顯減弱，缺血誘導(dǎo)的凋亡細胞數(shù)減少，神經(jīng)細胞的異常形態(tài)結(jié)構(gòu)以及神經(jīng)行為功能明顯改善。提示NRG-1β可能是通過抑制HPK1的表達進而發(fā)揮抗凋亡和神經(jīng)保護的作用。

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