適量銅對(duì)BALB/c小鼠結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的影響

[摘要] 目的 通過建立BALB/c小鼠結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移模型探討銅對(duì)肝轉(zhuǎn)移及轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的影響。方法 采用脾臟注射合并去脾法建立結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移模型。將48只雄性BALB/c小鼠按照體質(zhì)量隨機(jī)分為4組，每組12只，分別是對(duì)照組、銅組（0.3 mg/kg）、四硫鉬酸銨鹽（TM）組（1.0 mg）、銅+TM組（0.3 mg/kg銅+1.0 mg TM）。采用灌胃方式提前干預(yù)1周，術(shù)后第2天開始，給予同樣的灌胃方式，同時(shí)TM組和銅+TM組給予1.0 mg 的TM，持續(xù)4周左右處死小鼠，觀察瘤結(jié)節(jié)數(shù)和肝轉(zhuǎn)移率。采用免疫組化法檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶7（MMP7）和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）與轉(zhuǎn)移有關(guān)因子的表達(dá)。結(jié)果 各組小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)趨勢(shì)大致相同，實(shí)驗(yàn)期間體質(zhì)量變化無明顯差異（F=0.749，P>0.05）。銅組較對(duì)照組和銅+TM組的瘤結(jié)節(jié)數(shù)顯著增多（t=5.93、8.64，P<0.05），對(duì)照組與TM組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.38，P<0.05）。銅組肝轉(zhuǎn)移率較其他3組均有所升高。銅組與對(duì)照組及銅+TM組比較，MMP7和VEGF蛋白的表達(dá)有所升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=7.064、31.595，P<0.05）。結(jié)論 適量銅可以促進(jìn)結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移腫瘤的發(fā)生，引起轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白表達(dá)變化，從而促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)展進(jìn)程。

[關(guān)鍵詞] 銅；結(jié)直腸腫瘤；腫瘤轉(zhuǎn)移；肝；基質(zhì)金屬蛋白酶7；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子類

[中圖分類號(hào)] R348.1；R73-37

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A

[文章編號(hào)] 2096-5532（2018）03-0263-06

根據(jù)美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)最新報(bào)道，結(jié)直腸癌在男性和女性的發(fā)病率和死亡率均居十大癌癥類型的第3位[1]。肝轉(zhuǎn)移發(fā)生是其病情惡化及死亡的主要原因[2-3]。銅作為一種必需過渡金屬元素天然存在于土壤、水、空氣中，是人體和動(dòng)物組織一種必需的微量營(yíng)養(yǎng)素，在人體正常的新陳代謝過程中發(fā)揮重要作用，參與循環(huán)功能、呼吸作用、消化功能、內(nèi)分泌功能等，同時(shí)也是多種酶的重要組成成分，在各種催化作用中發(fā)揮生物效應(yīng)[4-6]。前期研究發(fā)現(xiàn)，銅在多種癌癥病人（肝癌[7]、口腔癌[8]、前列腺癌[9]等）中水平顯著上升。高銅血癥胰島細(xì)胞癌多階段腫瘤發(fā)生小鼠模型顯示，從斷奶（4周齡）到接近生長(zhǎng)尾聲階段（15周）長(zhǎng)期慢性飲用20 mol/L的銅時(shí)， 其總腫瘤體積增加了1倍，表明銅是腫瘤生長(zhǎng)的一個(gè)限速營(yíng)養(yǎng)素[10]。許多G-蛋白偶聯(lián)受體（GPCRs）通過與低氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）相互作用，促使血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）表達(dá)，從而啟動(dòng)血管生成[11]。在一定時(shí)間內(nèi)，隨著硫酸銅濃度的逐漸升高，HIF-1α、G蛋白偶聯(lián)雌激素受體（GPER）、VEGF mRNA的水平逐漸上升，提示銅能促進(jìn)腫瘤血管生成[12]。但是，關(guān)于銅與實(shí)體瘤轉(zhuǎn)移關(guān)系的研究較少，尤其是銅與結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的關(guān)系鮮有報(bào)道。因此，為了探討銅對(duì)結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移發(fā)生發(fā)展的影響，本實(shí)驗(yàn)在先前研究的基礎(chǔ)上，經(jīng)脾注射去脾法建立肝轉(zhuǎn)移模型，首次觀察銅對(duì)結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移及轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的影響，并對(duì)其促轉(zhuǎn)移機(jī)制進(jìn)行初步探討。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

小鼠結(jié)腸腺癌細(xì)胞株（CT-26）購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。CT-26細(xì)胞用含體積分?jǐn)?shù)為0.01的胎牛血清和10 g/L青鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性BALB/c小鼠48只，6～8周齡，平均體質(zhì)量為20～22 g（山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司提供，許可證號(hào)SCXK Lu 20130001）。在環(huán)境平均溫度（24±2）℃、平均濕度（52±8）%、無特定病原體（SPF）的條件下，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自由飲水。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

硫酸銅（CuSO4·5H2O，純度99%，天津市永大化學(xué)試劑開發(fā)中心），四硫代鉬酸銨鹽（TM，純度99.97%，美國(guó)Sigma公司），MMP7與VEGF抗體均購(gòu)自Proteintech公司。

1.4 結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移模型建立

用體積分?jǐn)?shù)為0.025的三溴乙醇工作液腹腔注射麻醉BALB/c小鼠（15 μL/g），成功麻醉后側(cè)臥位固定，于小鼠背側(cè)中部、左側(cè)腋中線與腋后線間，取0.5 cm左右切口進(jìn)腹，暴露脾臟。用4號(hào)針頭于脾臟下級(jí)沿脾臟縱軸進(jìn)針，深約1.5 cm，邊退邊注入CT-26細(xì)胞懸液（細(xì)胞密度為1×109/L，劑量為0.2 mL），注射部位可見脾被膜變白隆起（輕輕按揉3～5 min，使腫瘤細(xì)胞進(jìn)入脾靜脈，造成血路播散），緩緩拔針后用蘸有絡(luò)合碘的消毒棉簽輕壓針眼處1 min，防止癌細(xì)胞外漏。5 min后結(jié)扎脾臟并切除，檢查無出血后逐層關(guān)腹縫合。

1.5 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥

小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，以體質(zhì)量作為匹配因素，按隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)分為4組（每組12只）：對(duì)照組（A組），銅組（B組），TM組（C組），銅+TM組（D組），銅組和銅+TM組給予0.3 mg/kg的硫酸銅溶液進(jìn)行灌胃，對(duì)照組和TM組以等體積蒸餾水代替。干預(yù)1周后（給予一定量的銅刺激），進(jìn)行造模，造模24 h后，再對(duì)小鼠以相同方式進(jìn)行灌胃。同時(shí)，TM組及銅+TM組給予1 mg的TM灌胃。各組持續(xù)4周左右。

1.6 動(dòng)物處理及樣本收集

于末次灌胃后12 h（禁食不禁水），摘取眼球取血處死小鼠。對(duì)其進(jìn)行解剖學(xué)觀察，稱肝臟質(zhì)量、測(cè)量腫瘤長(zhǎng)度和寬度，用40 g/L的甲醛固定，制作石蠟切片，進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）常規(guī)染色。計(jì)算肝轉(zhuǎn)移率、計(jì)數(shù)肝臟瘤結(jié)節(jié)數(shù)。

1.7 免疫組化方法檢測(cè)

組織固定包埋制成石蠟切片，常規(guī)脫蠟水化，用體積分?jǐn)?shù)為0.03的H2O2室溫孵育20 min。使用檸檬酸對(duì)切片實(shí)施抗原修復(fù)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需添加稀釋過的一抗，4 ℃冰箱過夜孵育，然后PBS沖洗2 min，共3次。添加經(jīng)多聚體HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體，于37 ℃常規(guī)孵育30 min，然后PBS沖洗2 min，共3次。DAB顯色，光鏡下觀察至出現(xiàn)棕黃色反應(yīng)時(shí)停止染色。用雙蒸水充分沖洗組織切片，然后用蘇木精復(fù)染。將組織切片行梯度乙醇溶液脫水，二甲苯透明、中性樹膠封片。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以[AKx-D]±s表示，采用析因設(shè)計(jì)的方差分析檢測(cè)銅和TM有無交互作用，多組比較選用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)各組BALB/c小鼠體質(zhì)量變化趨勢(shì)

實(shí)驗(yàn)過程中，每周定期稱量各組小鼠的體質(zhì)量，做好記錄。在每天對(duì)小鼠實(shí)施常規(guī)灌胃的情況下，存活的BALB/c小鼠生長(zhǎng)狀態(tài)良好，沒有不良反應(yīng)，飲水、進(jìn)食情況正常，能夠自由活動(dòng)，大小便正常。各組實(shí)驗(yàn)小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)趨勢(shì)大致相同，各組小鼠間體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.749，P>0.05）。見圖1。

2.2 各組小鼠肝轉(zhuǎn)移情況

實(shí)驗(yàn)期間，4組小鼠由于造模、灌胃和腹水瘤等原因，均出現(xiàn)不同程度的死亡情況。解剖觀察顯示，大小不等的腫瘤結(jié)節(jié)分布于肝臟表面，其中對(duì)照組小鼠結(jié)節(jié)較多；TM組小鼠相比于對(duì)照組結(jié)節(jié)分布較少；銅組結(jié)節(jié)分布最廣，數(shù)量最多；銅+TM組小鼠相比于銅組結(jié)節(jié)分布較少。見圖2。肝臟瘤結(jié)節(jié)經(jīng)病理切片確診為低分化腺癌。HE染色結(jié)果顯示，各組小鼠腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，形態(tài)大小不一。與對(duì)照組比較，銅組小鼠核染色較深，核分裂象增多，核漿比例增大；TM組小鼠細(xì)胞排列稀疏，核固縮淡染；銅+TM組小鼠相比于銅組核染色較淺，數(shù)目減少。見圖3。最終各組小鼠數(shù)量、腫瘤質(zhì)量和肝臟瘤結(jié)節(jié)數(shù)見表1。析因設(shè)計(jì)的方差分析顯示，銅和TM對(duì)肝臟腫瘤質(zhì)量無交互作用（F=0.900，P=0.354）。單因素方差分析顯示，各組小鼠腫瘤質(zhì)量之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=2.434，P=0.095）。析因設(shè)計(jì)的方差分析顯示，銅和TM對(duì)肝臟瘤結(jié)節(jié)數(shù)有交互作用（F=14.875，P<0.05）。

單因素方差分析顯示，對(duì)照組與TM組及銅組小鼠肝臟瘤結(jié)節(jié)數(shù)比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.38、5.93，P<0.05），銅組和銅+TM組小鼠肝臟瘤結(jié)節(jié)數(shù)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.93、8.64，P<0.05）。

2.3 銅對(duì)各組肝轉(zhuǎn)移組織MMP7和VEGF蛋白表達(dá)的影響

免疫組化分析結(jié)果顯示，銅可以增加MMP7以及VEGF蛋白的表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=7.064、31.595，P<0.05）。見表2。

3 討論

本研究采用經(jīng)脾注射去脾法建立小鼠結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移模型[13]，這種方法可以較好地模擬人結(jié)直腸癌細(xì)胞血行轉(zhuǎn)移至肝臟的途徑。腫瘤細(xì)胞在結(jié)直腸內(nèi)增生，構(gòu)建其自身的血液供給，侵襲相鄰的組織并滲入到血液循環(huán)，黏附到肝臟的血管壁上，侵襲肝臟，克隆性增生，促進(jìn)轉(zhuǎn)移瘤的形成[14]。本研究結(jié)果顯示，銅組小鼠肝瘤結(jié)節(jié)數(shù)與對(duì)照組比較顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而且銅組的肝轉(zhuǎn)移率較其他3組也有升高的趨勢(shì)。表明銅對(duì)結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移具有一定的促進(jìn)作用。

世界衛(wèi)生組織建議，成人銅的每天適宜攝入量（AI）為2 mg/d，可耐受最高攝入量（UL）為8 mg/d。本實(shí)驗(yàn)銅的灌胃劑量是以人每天的AI值以及人與小鼠藥物劑量換算系數(shù)為依據(jù)計(jì)算得到的，與美國(guó)環(huán)境保護(hù)局（EPA）建議的公共飲用水中所允許的最大含銅量20 mol/L基本相符[10]，所以本實(shí)驗(yàn)是在適量銅濃度下進(jìn)行的研究。

在對(duì)銅促結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究中，我們觀察到了銅對(duì)轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白MMP7和VEGF表達(dá)的調(diào)節(jié)。結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移是一個(gè)動(dòng)態(tài)的調(diào)節(jié)過程，脫離原發(fā)灶，腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）黏附增強(qiáng)，腫瘤細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞分泌的多種不同蛋白或酶類誘導(dǎo)ECM降解，形成腫瘤細(xì)胞遷移通道，實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。定居靶器官后，腫瘤細(xì)胞需要建立自己的血管系統(tǒng)以提供其生長(zhǎng)、增殖所需氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[15]，而腫瘤細(xì)胞自身分泌的促血管生長(zhǎng)因子，又可以促進(jìn)腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖。因此，基質(zhì)金屬蛋白酶類（MMPs）和VEGF對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移過程以及轉(zhuǎn)移后的再生長(zhǎng)起重要的作用[16-17]。

MMPs家族是一種Zn2+依賴性內(nèi)肽酶，在細(xì)胞外環(huán)境中存在，可以作為降解ECM的一把利刃[17]。MMP7是MMPs家族中結(jié)構(gòu)最小的成員，對(duì)ECM成分有廣泛的底物特異性，在多種惡性腫瘤中過表達(dá)，可以降解基膜，對(duì)轉(zhuǎn)移過程起著重要作用[18]。一項(xiàng)關(guān)于結(jié)直腸癌病人的研究發(fā)現(xiàn)，MMP7在晚期癌癥病人中普遍高表達(dá)，Ⅲ/Ⅳ期的癌癥病人血清中的MMP7表達(dá)水平顯著高于癌組織和非轉(zhuǎn)移性組織[19]。還有研究顯示，MMP7表達(dá)上調(diào)會(huì)相應(yīng)地增加垂體腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、侵襲能力，對(duì)腫瘤的發(fā)展具有一定的促進(jìn)作用[20]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，銅組小鼠MMP7的表達(dá)水平顯著升高，與其他3組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而銅+TM組MMP7的表達(dá)水平較銅組降低。因此，銅在一定程度上可以通過刺激MMPs的分泌，誘導(dǎo)ECM降解，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。

腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)需要新生血管提供的氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，血管生成又可促進(jìn)腫瘤快速生長(zhǎng)增殖[21]，而腫瘤細(xì)胞本身分泌的促血管生成因子，又能夠促進(jìn)腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，因此，腫瘤新生血管對(duì)轉(zhuǎn)移灶的形成比原發(fā)灶產(chǎn)生的影響更為顯著。腫瘤血管生成是由血管生成因子釋放發(fā)揮作用的，較為周知的血管成因子有VEGF、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、（TGF、）等。而VEGF是其中作用最為重要的一個(gè)因素[22]。有研究結(jié)果顯示，VEGF的表達(dá)與腫瘤大小、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，而且VEGF高表達(dá)可以促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)增殖，提示與胃癌病人預(yù)后差顯著相關(guān)[23]。一項(xiàng)研究表明，VEGF的表達(dá)與高TNM分期、細(xì)胞分化程度以及病人生存率顯著相關(guān)，高表達(dá)的VEGF可以促進(jìn)結(jié)直腸癌的生長(zhǎng)增殖、轉(zhuǎn)移，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[24-25]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，銅組VEGF的表達(dá)水平較對(duì)照組顯著升高，而加入TM螯合劑以后，VEGF的表達(dá)水平有所下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。銅作為VEGF表達(dá)過程中重要的影響因素，其促VEGF表達(dá)的研究已有20多年。VEGF的表達(dá)對(duì)于銅的添加很敏感，在正常生理濃度的銅的誘導(dǎo)下，硫酸銅溶液就可以引起VEGF的表達(dá)；同時(shí)，銅也能誘導(dǎo)低氧條件下VEGF的表達(dá)，其對(duì)于腫瘤快速生長(zhǎng)增殖起著不可忽視的作用[26]。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道相符，表明銅可以通過刺激VEGF的表達(dá)而促進(jìn)腫瘤血管生成，增強(qiáng)腫瘤的轉(zhuǎn)移能力。TM療法是治療銅超負(fù)荷疾病的一種新方法[27]。它的作用主要通過與銅和血清清蛋白形成穩(wěn)定的三聯(lián)復(fù)合物來實(shí)現(xiàn)，使細(xì)胞不能利用銅，從而減少了對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)[28]。更重要的是，TM是一個(gè)相對(duì)無毒的銅離子螯合劑，可緊密結(jié)合并清除體液中的銅，并經(jīng)尿液排除[29]。TM已經(jīng)用于臨床前和動(dòng)物模型中，可能是一種很有前途的可替代的抗癌和抗血管生成劑。Ⅰ期和Ⅱ期臨床試驗(yàn)顯示，使用TM對(duì)實(shí)體瘤都有較好的效果和可接受毒性[30]。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也表明，TM組的肝轉(zhuǎn)移率、瘤結(jié)節(jié)數(shù)量以及MMP7和VEGF的表達(dá)均有所降低，對(duì)于肝轉(zhuǎn)移的發(fā)生、發(fā)展產(chǎn)生一定的抑制作用，可以抵抗銅引起的促轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，為臨床治療銅引發(fā)的肝轉(zhuǎn)移提供了一定的理論基礎(chǔ)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過建立BALB/c小鼠結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移模型，模擬了人結(jié)直腸癌細(xì)胞血行轉(zhuǎn)移至肝臟的途徑和過程。觀察銅對(duì)MMP7和VEGF表達(dá)的調(diào)節(jié)，初步探討了銅促結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移作用機(jī)制，對(duì)于臨床工作者治療結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移提供一定的理論依據(jù)，觀察到了銅對(duì)小鼠結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移發(fā)生發(fā)展的促進(jìn)作用以及促進(jìn)MMP7和VEGF的表達(dá)，可以為以后結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移治療提供一定病因?qū)W及預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移進(jìn)程等方面的參考意見。

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